第二章　微生物培养技术

【知识目标】

（1）了解微生物细胞的化学组成和培养基的配制原则。

（2）掌握微生物的营养要素及其生理功能、营养物质进入细胞的方式和培养基的类型和应用。

【能力目标】

按照企业岗位要求独立配制实验室和工业生产用的培养基，为今后走上工作岗位打下坚实的基础。

第一节　工业微生物的营养要求

一、微生物细胞的化学组成

微生物细胞的化学成分以有机物和无机物两种状态存在。有机物包含各种大分子，它们是蛋白质、核酸、类脂和糖类，占细胞干重的99％。无机成分包括小分子无机物和各种离子，占细胞干重的1％。

微生物细胞的元素构成：由C、H、O、N、P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo等组成。其中C、H、O、N、P、S六种元素占微生物细胞干重的97％；其他为微量元素。微生物细胞的化学元素组成的比例常因微生物种类的不同而各异。

组成微生物细胞的化学元素分别来自微生物生长所需的营养物质，即微生物生长所需的营养物质应该包含有组成细胞的各种化学元素。这些物质概括为提供构成细胞物质的碳素来源的碳源物质，构成细胞物质的氮素来源的氮源物质和一些含有K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo元素的无机盐。

二、微生物的营养物质及其生理功能

微生物生长所需要的营养物质主要是以有机物和无机物的形式提供的，小部分由气体物质供给。微生物的营养物质按其在机体中的生理作用可区分为：碳源、氮源、无机盐、生长因子和水五大类。

1.碳源

在微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。

从简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐到各种各样的天然有机化合物都可以作为微生物的碳源，但不同的微生物利用含碳物质具有选择性，利用能力有差异（表2-1）。

碳源的生理作用主要有：碳源物质通过复杂的化学变化来构成微生物自身的细胞物质和代谢产物；同时多数碳源物质在细胞内生化反应过程中还能为机体提供维持生命活动的能量，但有些以CO2为唯一或主要碳源的微生物生长所需的能源则不是来自CO2。

2.氮源

凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中氮素来源的营养物质通称为氮源物质。

能被微生物所利用的氮源物质有蛋白质及其各类降解产物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、分子态氮、嘌呤、嘧啶、脲、酰胺、氰化物（表2-2）。

氮源物质常被微生物用来合成细胞中含氮物质，少数情况下可做能源物质，如某些厌氧微生物在厌氧条件下可利用某些氨基酸作为能源。

微生物对氮源的利用具有选择性，如玉米浆相对于豆饼粉，相对于为速效氮源。铵盐作为氮源时会导致培养基pH值下降，称为生理酸性盐；而以硝酸盐作为氮源时培养基pH值会升高，称为生理碱性盐。

3.能源

能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源。由于各种异养微生物的能源就是其碳源，因此，它们的能源谱就显得十分简单。

化能自养微生物的能源十分独特，它们都是一些还原态的无机物质，例如、、S、H2S、H2和Fe2+等。能利用这种能源的微生物都是一些原核生物，包括亚硝酸细菌、硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。

一部分微生物能够利用辐射能（光能）进行光合作用获得能源，称为光能营养型。

在能源中，更容易理解的是某一具体营养物质可同时兼有几种营养要素功能。例如光辐射能是单功能营养物（能源）；还原态的是双功能营养物（能源和氮源）；而氨基酸是三功能的营养物（碳源、能源和氮源）。

4.无机盐

无机盐是微生物生长必不可少的一类营养物质，它们在机体中的生理功能主要是作为酶活性中心的组成部分、维持生物大分子和细胞结构的稳定性、调节并维持细胞的渗透压平衡、控制细胞的氧化还原电位和作为某些微生物生长的能源物质等（表2-3）。

微生物生长所需的无机盐一般有磷酸盐、硫酸盐、氯化物以及含有钠、钾、钙、镁、铁等金属元素的化合物。

在微生物的生长过程中还需要一些微量元素，微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-8～10-6mol/L（培养基中含量）。微量元素一般参与酶的组成或使酶活化（表2-4）。

如果微生物在生长过程中缺乏微量元素，会导致细胞生理活性降低甚至停止生长。由于不同微生物对营养物质的需求不尽相同，微量元素这个概念也是相对的。微量元素通常混杂在天然有机营养物、无机化学试剂、自来水、蒸馏水、普通玻璃器皿中，如果没有特殊原因，在配制培养基时没有必要另外加入微量元素。值得注意的是，许多微量元素是重金属，如果它们过量，就会对机体产生毒害作用，而且单独一种微量元素过量产生的毒害作用更大，因此有必要将培养基中微量元素的量控制在正常范围内，并注意各种微量元素之间保持恰当比例。

5.生长因子

生长因子通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。

根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同，可将生长因子分为维生素、氨基酸和嘌呤与嘧啶三大类（表2-5）。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长；嘌呤与嘧啶作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。

6.水

水是微生物生长所必不可少的。水在细胞中的生理功能主要有：（1）起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；（2）参与细胞内一系列化学反应；（3）维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；（4）因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，从而有效地控制细胞内温度的变化；（5）保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素；（6）微生物通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如酶、微管、鞭毛及病毒颗粒的组装与解离。

微生物生长的环境中水的有效性常以水活度值（wateractivity，Aw）表示，水活度值是指在一定的温度和压力条件下，溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比，即Aw=Pw/P0w，式中，Pw代表溶液蒸汽压力，P0w代表纯水蒸汽压力。纯水Aw为1.00，溶液中溶质越多，Aw越小。微生物一般在Aw为0.60～0.99的条件下生长，Aw过低时，微生物生长的迟缓期延长，比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适Aw不同（表2-6）。一般而言，细菌生长最适Aw较酵母菌和霉菌高，而嗜盐微生物生长最适Aw则较低。

三、微生物的营养类型

由于微生物种类繁多，其营养类型比较复杂，人们常在不同层次和侧重点上对微生物营养类型进行划分（表2-7）。根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将绝大部分微生物分为光能无机自养型、光能有机异养型、化能无机自养型及化能有机异养型四种类型（表2-8）。

光能无机自养型和光能有机异养型微生物可利用光能生长，在地球早期生态环境的演化过程中起重要作用；化能无机自养型微生物广泛分布于土壤及水环境中，参与地球物质循环；对化能有机异养型微生物而言，有机物通常既是碳源也是能源。目前已知的大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物。值得注意的是，已知的所有致病微生物都属于此种类型。根据化能有机异养型微生物利用的有机物性质的不同，又可将它们分为腐生型和寄生型两类，前者可利用无生命的有机物（如动植物尸体和残体）作为碳源，后者则寄生在活的寄主机体内吸取营养物质，离开寄主就不能生存。在腐生型和寄生型之间还存在一些中间类型，如兼性腐生型和兼性寄生型。

某些菌株发生突变（自然突变或人工诱变）后，失去合成某种（或某些）对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子如氨基酸、维生素）的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型，相应的野生型菌株称为原养型。营养缺陷型菌株经常用来进行微生物遗传学方面的研究。

必须明确，无论哪种分类方式，不同营养类型之间的界限并非绝对的，异养型微生物并非绝对不能利用，只是不能以CO2为唯一或主要碳源进行生长，而且在有机物存在的情况下也可将CO2同化为细胞物质。同样，自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长。另外，有些微生物在不同生长条件下生长时，其营养类型也会发生改变，例如紫色非硫细菌在没有有机物时可以同化CO2，为自养型微生物，而当有有机物存在时，它又可以利用有机物进行生长，此时它为异养型微生物。再如，紫色非硫细菌在光照和厌氧条件下可利用光能生长，为光能营养型微生物，而在黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，则为化能营养型微生物。微生物营养类型的可变性无疑有利于提高微生物对环境条件变化的适应能力。

1.光能无机自养型

光能无机自养型也称光能自养型，这是一类能以CO2为唯一碳源或主要碳源并利用光能进行生长的微生物，它们能以无机物如水、硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机化合物为电子供体，使CO2固定还原成细胞物质，并且伴随元素氧（硫）的释放。

藻类、蓝细菌和光合细菌属于这一营养类型。

藻类和蓝细菌：

这与高等植物光合作用是一致的。

光合细菌：

这与藻类、蓝细菌和高等植物是不同的。

2.化能无机自养型

化能无机自养型或称化能自养型，这类微生物利用无机物氧化过程中放出的化学能作为它们生长所需的能量，以CO2或碳酸盐作为唯一的或主要碳源进行生长，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质。

属于这类微生物的类群有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌等（参见微生物的产能方式）。

例如氢细菌：

3.光能有机异养型

光能有机异养型或称光能异养型，这类微生物不能以CO2作为唯一碳源或主要碳源，需以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质。

红螺属的一些细菌就是这一营养类型的代表：

光能有机异养型细菌在生长时通常需要外源生长因子。

4.化能有机异养型

化能有机异养型或称化能异养营养型，这类微生物生长所需的能量来自有机物氧化过程放出的化学能，生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。对于化能有机异养型微生物来说，有机物通常既是它们生长的碳源物质又是能源物质。

目前在已知的微生物大多数属于化能有机异养型：绝大多数的细菌、全部真菌、原生动物以及病毒。

如果化能有机异养型微生物利用的有机物不具有生命活性，则是腐生型；若是生活在生活细胞内从寄生体内获得营养物质，则是寄生型。

第二节　营养物质进入细胞的形式

营养物质能否被微生物利用的一个决定性因素是这些营养物质能否进入微生物细胞。只有营养物质进入细胞后才能被微生物细胞内的新陈代谢系统分解利用，进而使微生物正常生长繁殖。

影响营养物质进入细胞的因素主要有三个。

其一是营养物质本身的性质。相对分子质量、溶解性、电负性、极性等都影响营养物质进入细胞的难易程度。

其二是微生物所处的环境。温度通过影响营养物质的溶解度、细胞膜的流动性及运输系统的活性来影响微生物的吸收能力；pH值和离子强度通过影响营养物质的电离程度来影响其进入细胞的能力。例如，当环境pH值比细胞内pH值高时，弱碱性的甲胺进入大肠杆菌后以带正电荷的形式存在，而这种状态的甲胺不容易分泌而导致细胞内甲胺浓度升高；当环境pH值比细胞内pH值低时，甲胺以带正电荷的形式存在于环境中而难以进入细胞，导致细胞内甲胺浓度降低；当环境中存在诱导物质运输系统形成的物质时，有利于微生物吸收营养物质；而当环境中存在代谢过程抑制剂、解偶联剂以及能与原生质膜上的蛋白质或脂类物质等成分发生作用的物质（如疏基试剂、重金属离子等）都可以在不同程度上影响物质的运输速率。另外，环境中被运输物质的结构类似物也影响微生物细胞吸收被运输物质的速率，例如L-刀豆氨酸、L-赖氨酸或D-精氨酸都能降低酿酒酵母吸收L-精氨酸的能力。

其三是微生物细胞的透过屏障。所有微生物都具有一种保护机体完整性且能限制物质进出细胞的渗透屏障。渗透屏障是由原生质膜、细胞壁、荚膜及黏液层等组成的结构。荚膜与黏液层的结构较为疏松，对细胞吸收营养物质影响较小。革兰阳性细菌由于细胞壁结构较为紧密，对营养物质的吸收有一定的影响，相对分子质量大于10000的葡聚糖难以通过这类细菌的细胞壁。真菌和酵母菌细胞壁只能允许相对分子质量较小的物质通过。与细胞壁相比，原生质膜在控制物质进入细胞的过程中起着更为重要的作用，它对跨膜运输的物质具有选择性，营养物质的跨膜运输是本节着重探讨的问题。根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为扩散、促进扩散、主动运输与膜泡运输。

一、扩散

1.扩散

原生质膜是一种半透膜，营养物质通过原生质膜上的含水小孔，由高浓度的胞外（内）环境向低浓度的胞内（外）进行扩散。扩散是非特异性的，但原生质膜上的含水小孔的大小和形状对参与扩散的营养物质分子有一定的选择性。物质在扩散过程中，既不与膜上的各类分子发生反应，自身分子结构也不发生变化。

2.扩散的特点

扩散是一种最简单的物质跨膜运输方式，为纯粹的物理学过程，在扩散过程中不消耗能量，物质扩散的动力来自参与扩散的物质在膜内外的浓度差，营养物质不能逆浓度运输。物质扩散的速率随原生质膜内外营养物质浓度差的降低而减小，直到膜内外营养物质浓度相同时才达到一个动态平衡。

由于原生质膜主要由磷脂双分子层和蛋白质组成，而且膜上分布有含水小孔，膜内外表面为极性表面，中间为疏水层，因而物质跨膜扩散的能力和速率与该物质的性质有关，相对分子质量小、脂溶性、极性小的物质易通过扩散进出细胞。另外，温度高时，原生质膜的流动性增加，有利于物质通过扩散进出细胞，而pH值与离子强度通过影响物质的电离程度而影响物质的扩散速率。

3.通过扩散运输的营养物质

扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式，水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子（O2、CO2）及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。

二、促进扩散

1.促进扩散

促进扩散与扩散一样，促进扩散也是一种被动的物质跨膜运输方式，在这个过程中不消耗能量，参与运输的物质本身的分子结构不发生变化，不能进行逆浓度运输，运输速率与膜内外物质的浓度差成正比。

2.促进扩散的特点

促进扩散与扩散的主要区别在于通过促进扩散进行跨膜运输的物质需要借助于载体的作用力才能进入细胞（图2-1），而且每种载体只运输相应的物质，具有较高的专一性。被运输物质与相应载体之间存在一种亲和力，而且这种亲和力在原生质膜内外的大小不同，当物质与相应载体在胞外亲和力大而在胞内亲和力小时，通过被运输物质与相应载体之间亲和力的大小变化，使该物质与载体发生可逆性的结合与分离，导致物质穿过原生质膜进入细胞。被运输物质与载体之间亲和力大小变化是通过载体分子的构象变化而实现的。参与促进扩散的载体主要是一些蛋白质，这些蛋白质能促进物质进行跨膜运输，自身在这个过程中不发生化学变化，而且在促进扩散中载体只影响物质的运输速率，并不改变该物质在膜内外形成的动态平衡状态，被运输物质在膜内外浓度差越大，促进扩散的速率越快，但是当被运输物质浓度过高而使载体蛋白饱和时，运输速率就再不增加，这些性质都类似于酶的作用特征，因此载体蛋白也称为透过酶。透过酶大多是诱导酶，只有在环境中存在机体生长所需的营养物质时，相应的透过酶才合成。

3.通过促进扩散运输的营养物质

通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质，但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成，例如鼠伤寒沙门菌利用四种不同载体蛋白运输组氨酸，酿酒酵母有三种不同的载体蛋白来完成葡萄糖的运输。另外，某些载体蛋白可同时完成几种物质的运输，例如大肠杆菌可通过一种载体蛋白完成亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的运输，但这种载体蛋白对这三种氨基酸的运输能力有差别。

除以蛋白质载体介导的促进扩散外，一些抗生素可以通过提高膜的离子通透性而促进离子进行跨膜运输。短杆菌肽A是由15个L型和D型氨基酸交替连接而成的短肽，两个短杆菌肽A分子可在膜上形成含水通道，离子可以穿过此通道进行跨膜运输；缬氨霉素是一种环状分子，K+可结合在环状分子中心，而环状分子外周的碳氢链使得该复合物能穿过膜的疏水性中心，从而促进K+的跨膜运输，在这个过程中，缬氨霉素实际上起到载体的作用。

三、主动运输

主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。与扩散及促进扩散这两种被动运输方式相比，主动运输的一个重要特点是在物质运输过程中需要消耗能量，而且可以进行逆浓度运输。在主动运输过程中，运输物质所需能量来源因微生物不同而不同，好氧型微生物与兼性厌氧型微生物直接利用呼吸能，厌氧型微生物利用化学能（ATP），光合微生物利用光能，嗜盐细菌通过紫膜利用光能。主动运输与促进扩散类似之处在于物质运输过程中同样需要载体蛋白，载体蛋白通过构象变化而改变与被运输物质之间的亲和力大小，使两者之间发生可逆性结合与分离，从而完成相应物质的跨膜运输，区别在于主动运输过程中的载体蛋白构象变化需要消耗能量。主动运输的具体方式有多种，主要有初级主动运输、次级主动运输、基团转位、Na+，K+-ATP酶（Na+，K+-ATPase）系统及ATP偶联主动运输等。

1.初级主动运输

初级主动运输指由电子传递系统、ATP酶或细菌嗜紫红质引起的质子运输方式，从物质运输的角度考虑是一种质子的主动运输方式。呼吸能、化学能和光能的消耗，引起胞内质子（或其他离子）外排，导致原生质膜内外建立质子浓度差（或电势差），使膜处于充能状态（图2-2），即形成能化膜。不同微生物的初级主动运输方式不同，好氧型微生物和兼性厌氧型微生物在有氧条件下生长时，物质在胞内氧化释放的电子在位于原生质膜上的电子传递链上传递的过程中伴随质子外排；厌氧型微生物利用发酵过程中产生的ATP，在位于原生质膜上的ATP酶的作用下，ATP水解生成ADP和磷酸，同时伴随质子向胞外分泌；光合微生物吸收光能后，光能激发产生的电子在电子传递过程中也伴随质子外排；嗜盐细菌紫膜上的细菌嗜紫红质吸收光能后，引起蛋白质分子中某些化学基团pKa值发生变化，导致质子迅速转移，在膜内外建立质子浓度差。

2.次级主动运输

通过初级主动运输建立的能化膜在质子浓度差（或电势差）消失的过程中，往往偶联其他物质的运输，包括以下三种方式。同向运输是指某种物质与质子通过同一载体按同一方向运输（图2-2a）。除质子外，其他带电荷离子（如钠离子）建立起来的电势差也可引起同向运输。在大肠杆菌中，通过这种方式运输的物质主要有丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、半乳糖、岩藻糖、蜜二糖、阿拉伯糖、乳酸、葡萄糖醛酸及某些阴离子（如、）等。逆向运输是指某种物质（如Na+）与质子通过同一载体按相反方向进行运输（图2-2b）。单向运输是指质子浓度差在消失过程中，可促使某些物质通过载体进出细胞（图2-2c），运输结果通常导致胞内阳离子（如K+）积累或阴离子浓度降低。

3.基团转位

基团转位与其他主动运输方式的不同之处在于它有一个复杂的运输系统来完成物质的运输，而物质在起输过程中发生化学变化。基团转位主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细菌中，主要用于糖的运输，脂肪酸、核苷、碱基等也可通过这种方式运输。目前尚未在好氧型细菌及真核生物中发现这种运输方式，也未发现氨基酸通过这种方式进行运输。

在研究大肠杆菌对葡萄糖和金黄色葡萄球菌对乳糖的吸收过程中，发现这些糖进入细胞后以磷酸糖的形式存在于细胞质中，表明这些糖在运输过程中发生了磷酸化作用，其中的磷酸基团来源于胞内的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），因此也将基团转位称为磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖转移酶运输系统（PTS），简称磷酸转移酶系统（图2-3）。PTS通常由五种蛋白质组成，包括酶Ⅰ、酶Ⅱ（包括a、b和c三个亚基）和一种低相对分子质量的热稳定蛋白质（HPr）。酶Ⅰ和HPr是非特异性的细胞质蛋白，酶Ⅱa是可溶性细胞质蛋白，亲水性酶Ⅱb与位于细胞膜上的酶Ⅱc相结合。在糖的运输过程中，PEP上的磷酸基团逐步通过酶Ⅰ、HPr的磷酸化与去磷酸化作用，最终在酶Ⅱ的作用下转移到糖，生成磷酸糖释放于细胞质中。

4.Na+，K+-ATP酶（Na+，K+-ATPase）系统

丹麦学者斯克（J.C.Skou）在1957年发现了存在于原生质膜上的一种重要的离子通道蛋白——Na+，K+-ATP酶（Na+，K+-ATPase），时隔40年后，他与其他两位学者分享了1997年诺贝尔化学奖。Na+，K+-ATP酶的功能是利用ATP的能量将Na+由细胞内“泵”出至胞外，并将K+“泵”入胞内。该酶由大小两个亚基组成，大亚基可被磷酸化，其作用机制见图2-4。

E为非磷酸化酶，与Na+的结合位点朝向膜内，与Na+有较高的亲和力，而与K+的亲和力低。当E与Na+结合后，在Mg2+存在的情况下，ATP水解使E磷酸化，促使E构象发生变化而转变成E'，并导致与Na+的结合位点朝向膜外，E’与Na+的亲和力降低，而与K+的亲和力增高，此时胞外的K+将Na+置换下来，E’与K+结合后，K+的结合位点朝向膜内，E’去磷酸化，该酶构象再次发生变化，转变成E，Na+将K+置换下来。Na+，K+-ATP酶作用的结果是使细胞内Na+浓度低而K+浓度高，这种状况并不因环境中Na+、K+浓度高低而改变，例如大肠杆菌K12在培养基中K+浓度非常低（0.1mmol/L）时，仍然可以从环境中吸收K+，导致胞内K+浓度达到100mmol/L。细胞内维持高浓度K+是保证许多酶的活性和蛋白质的合成所必需的。由于Na+，K+-ATP酶将Na+由细胞内“泵”出至胞外，并将K+“泵”入胞内，因此常将该酶称为Na+，K+泵。

5.其他的主动运输方式

除上述四种主要的主动运输方式外，在微生物中还存在一些其他的主动运输方式。其中有一种是ATP水解不建立膜内外质子浓度差，而是直接偶联物质的运输，L-谷氨酰胺、L-鸟氨酰胺、L-鸟氨酸和D-核糖可以通过这种方式运输；在大肠杆菌中，能量的消耗可以导致柠檬酸透过酶的构象变化而使之活化，促进柠檬酸进入细胞；在金黄色葡萄球菌中，在脱氢酶作用下，乳酸氧化偶联着载体蛋白分子构象变化，促使物质进入细胞。

四、膜泡运输

膜泡运输主要存在于原生动物特别是变形虫中，是这类微生物的一种营养物质的运输方式（图2-5）。变形虫通过趋向性运动靠近营养物质，并将该物质吸附到膜表面，然后在该物质附近的细胞膜开始内陷，逐步将营养物质包围，最后形成一个含有该营养物质的膜泡，之后膜泡离开细胞膜而游离于细胞质中，营养物质通过这种运输方式由胞外进入胞内。如果膜泡中包含的是固体营养物质，则将这种营养物质运输方式称为胞吞作用；如果膜泡中包含的是液体，则称之为胞饮作用。通过胞吞作用（或胞饮作用）进行的营养物质膜泡运输一般分为五个时期（图2-5），即吸附期、膜伸展期、膜泡迅速形成期、附着膜泡形成期和膜泡释放期。

第三节　培养基

一、培养基的概念

培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。

培养基中应含满足微生物生长发育的：水分、碳源、氮源、生长因子以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、镁、钾和铁及各种微量元素。

此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。

二、配制培养基的原则

1.选择适宜的营养物质

总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物组成。例如，培养化能自养型的氧化硫硫杆菌的培养基组成见表2-9。在该培养基配制过程中并未专门加入其他碳源物质，而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。

就微生物主要类型而言，有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分，培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）培养细菌，用高氏Ⅰ号合成培养基培养放线菌，培养酵母菌一般用麦芽汁培养基，培养霉菌则一般用查氏合成培养基。

2.营养物质浓度及配比合适

培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。再如，在抗生素发酵生产过程中，可以通过控制培养基中速效氮（或碳）源与迟效氮（或碳）源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。

3.控制pH条件

培养基的pH值必须控制在一定范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH值条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH值7～7.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH值4.5～6范围内生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH值发生变化，若不对培养基pH值条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或（和）代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常在培养基中加入pH值缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐（如KH2PO4和K2HPO4）组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性，KH2PO4溶液呈酸性，两种物质的等量混合溶液的pH值为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时，H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基pH值不会过度降低；如果培养基中OH-浓度增加，OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基pH值也不会过度升高。

但KH2PO4和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH值范围（pH值6.4～7.2）内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐（如CaCO3）来进行调节，CaCO3难溶于水，不会使培养基pH值过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO2，将培养基pH值控制在一定范围内。

在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质，也可起到缓冲剂的作用。

4.控制氧化还原电位

不同类型微生物生长对氧化还原电位（Φ）的要求不一样，一般好氧型微生物在Φ值为+0.1V以上时可正常生长，一般以+0.3～+0.4V为宜，厌氧型微生物只能在Φ值低于+0.1V条件下生长，兼性厌氧型微生物在Φ值为+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时进行发酵。Φ值与氧分压和pH值有关，也受某些微生物代谢产物的影响。在pH值相对稳定的条件下，可通过增加通气量（如振荡培养、搅拌）提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Φ值；在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低Φ值。

5.原料来源的选择

在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中，常常利用糖蜜（制糖工业中含有蔗糖的废液）、乳清（乳制品工业中含有乳糖的废液）、豆制品工业废液及黑废液（造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆）等作为培养基的原料。再如，工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣做原料，而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外，大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。

6.灭菌处理

要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃条件下维持15～30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/cm2，112.6℃15～30min进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子（特别是钙离子、镁离子、铁离子）结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸（EDTA）。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH值会发生改变（一般使pH值降低），可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。

在配制培养基过程中，泡沫的存在对灭菌处理极不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭菌温度。

三、培养基的类型以及应用

培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。

（一）按成分不同划分

1.天然培养基

这类培养基含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物，也称非化学限定培养基。牛肉膏蛋白胨培养基和麦芽汁培养基就属于此类。基因克隆技术中常用的LB（Luria-Bertani）培养基也是一种天然培养基，其组成见表2-9。

常用的天然有机营养物质包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏（表2-10）、豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛乳、血清、稻草浸汁、羽毛浸汁、胡萝卜汁、椰子汁等。嗜粪微生物可以利用粪水作为营养物质。天然培养基成本较低，除在实验室经常使用外，也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。

2.合成培养基

是由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基，高氏Ⅰ号培养基和查氏培养基就属于此种类型。配制合成培养基时重复性强，但与天然培养基相比其成本较高，微生物在其中生长速度较慢，一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。

（二）根据物理状态划分

根据培养基中凝固剂的有无及含量的多少，可将培养基划分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种类型。

1.固体培养基

在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态即为固体培养基。理想的凝固剂应具备以下条件：①不被所培养的微生物分解利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态，在培养嗜热细菌时，由于高温容易引起培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂来解决这一问题；③凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；④凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；⑤凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；⑥透明度好，黏着力强；⑦配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。表2-11列出琼脂和明胶的一些主要特征。

对绝大多数微生物而言，琼脂是最理想的凝固剂，琼脂是从藻类（海产石花菜）中提取的一种高度分支的复杂多糖；明胶是由胶原蛋白制备得到的产物，是最早用来作为凝固剂的物质，但由于其凝固点太低，而且某些细菌和许多真菌产生的非特异性胞外蛋白酶以及梭菌产生的特异性胶原酶都能液化明胶，目前已较少作为凝固剂；硅胶是由无机的硅酸钠（Na2SO3）及硅酸钾（K2SiO3）被盐酸及硫酸中和时凝聚而成的胶体，它不含有机物，适合配制分离与培养自养型微生物的培养基。

除在液体培养基中加入凝固剂制备的固体培养基外，一些由天然固体基质制成的培养基也属于固体培养基。例如，由马铃薯块、胡萝卜条、小米、麸皮及米糠等制成固体状态的培养基就属于此类。又如生产酒的酒曲，生产食用菌的棉籽壳培养基。

在实验室中，固体培养基一般是加入平皿或试管中，制成培养微生物的平板或斜面。固体培养基为微生物提供一个营养表面，单个微生物细胞在这个营养表面进行生长繁殖，可以形成单个菌落。固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏等。

2.半固体培养基

半固体培养基中凝固剂的含量比固体培养基少，培养基中琼脂含量一般为0.2％～0.7％。半固体培养基常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。

3.液体培养基

液体培养基中未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，通过振荡或搅拌可以增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。液体培养基常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。

（三）按用途划分

1.基础培养基

尽管不同微生物的营养需求各不相同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。基础培养基也可以作为一些特殊培养基的基础成分，再根据某种微生物的特殊营养需求，在基础培养基中加入所需营养物质。

2.加富培养基

加富培养基也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基，这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，如培养百日咳博德菌需要含有血液的加富培养基。加富培养基还可以用来富集和分离某种微生物，这是因为加富培养基含有某种微生物所需的特殊营养物质，该种微生物在这种培养基中较其他微生物生长速度快，并逐渐富集而占优势，逐步淘汰其他微生物，从而容易达到分离该种微生物的目的。从某种意义上讲，加富培养基类似选择培养基，两者的区别在于：加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使所需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。

3.鉴别培养基

鉴别培养基是用于鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化，可将该种微生物与其他微生物区分开来。鉴别培养基主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。常用的一些鉴别培养基参见表2-12。

4.选择培养基

选择培养基是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。

一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养需求设计的，例如，利用以纤维素或石蜡油作为唯一碳源的选择培养基，可以从混杂的微生物群体中分离出能分解纤维素或石蜡油的微生物；利用以蛋白质作为唯一氮源的选择培养基，可以分离产胞外蛋白酶的微生物；缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物。

另一类选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物，例如，在培养基中加入数滴10％酚可以抑制细菌和霉菌的生长，从而由混杂的微生物群体中分离出放线菌；在培养基中加入亚硫酸铵，可以抑制革兰阳性细菌和绝大多数革兰阴性细菌的生长，而革兰阴性的伤寒沙门菌可以在这种培养基上生长；在培养基中加入染料亮绿或结晶紫，可以抑制革兰阳性细菌的生长，从而达到分离革兰阴性细菌的目的；在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素，可以抑制细菌和放线菌生长，而将酵母菌和霉菌分离出来。现代基因克隆技术中也常用选择培养基，在筛选含有重组质粒的基因工程菌株过程中，利用质粒上具有的对某种（些）抗生素的抗性选择标记，在培养基中加入相应抗生素，就能比较方便地淘汰非重组菌株，以减少筛选目标菌株的工作量。

5.其他

除上述四种主要类型外，培养基按用途划分还有很多种，比如：分析培养基常用来分析某些化学物质（抗生素、维生素）的浓度，还可用来分析微生物的营养需求；还原性培养基专门用来培养厌氧型微生物；组织培养物培养基含有动、植物细胞，用来培养病毒、衣原体、立克次体及某些螺旋体等专性活细胞寄生的微生物。尽管如此，有些病毒和立克次体目前还不能利用人工培养基来培养，需要接种在动植物体内、动植物组织中才能增殖。常用的培养病毒与立克次体的动物有小白鼠、家鼠和豚鼠，鸡胚也是培养某些病毒与立克次体的良好营养基质，鸡瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病病毒等十几种病毒也可用鸡胚培养。

第四节　工业发酵培养基制备

所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。

一、工业发酵培养基的营养成分

1.工业上常用的碳源

碳源是组成培养基的主要成分之一。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。在特殊情况下，蛋白质水解产物或氨基酸等也可被某些菌种作为碳源使用，由于菌种所含的酶系统不完全一样，各种菌种对不同碳源的利用速率和效率也不一样。葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作为培养基的一种主要成分，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。但是过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物（如丙酮酸、乳酸、乙酸等）不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH值下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。

糖蜜是制糖时的结晶母液，它是蔗糖厂的副产物。糖蜜含有较丰富的糖、氮素化合物和无机盐、维生素等，它是微生物工业价廉物美的原料。这种糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50％～75％，一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，两者糖的含量和无机盐的含量都有所不同，使用时应注意。糖蜜常用在酵母和丙酮、丁醇的生产中，抗生素等微生物工业也常用它作碳源。在酒精生产中若用糖蜜代甘薯粉，则可省去蒸煮、制曲、糖化等过程，简化了酒精的生产工艺。

淀粉、糊精等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。淀粉在发酵工业中被普遍使用，因为使用淀粉可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时其来源丰富，价格也比较低廉。常用的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉等。对有些微生物还可直接利用玉米粉、甘薯粉、土豆粉做碳源。见表2-13列出了工业上常用的碳源及其来源。

麦芽被广泛使用在啤酒工业中。纤维素和一些野生的含淀粉较多的植物也是今后开发碳源的广阔天地。

油和脂肪也能被许多微生物用作碳源和能源。这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶。在脂肪酸的作用下，油或脂肪被水解成甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和水，并释放出大量的能量。因此，当微生物利用脂肪做碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量脂肪酸和代谢中的有机酸积累，会引起培养液pH值下降，并影响微生物酶系统的作用。常用的油有豆油、菜籽油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等。

一些微生物对许多有机酸（乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力。因此有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。有机酸的利用常会使pH值上升，尤其是有机酸盐氧化经常伴随着碱性物质的产生，使pH值进一步上升。不同的碳源在其分解氧化时，对pH值的影响各不相同。因此不同的碳源和浓度不仅对微生物碳代谢有影响，而且对整个发酵过程中pH值的调节和控制也均有影响。

近年来随着石油工业的发展，微生物工业的碳源也有所扩大。正烷烃已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。甲醇已作为某些生产单细胞蛋白的工厂的主要碳源。另外，石油工业的发展也促使合成乙醇产量的增加。因此，近年来国外用乙醇代粮发酵的工艺发展也十分迅速。乙醇做碳源其菌体收率比葡萄糖等做碳源还高。据研究发现自然界中能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍，种类也相当多，现在已成功地应用在发酵工业的许多领域中。

2.工业上常用的氮源

工业生产上所用的微生物都能利用有机氮源和无机氮源，有机氮源包括玉米浆、花生饼粉、豆饼粉、棉籽粉、鱼粉、蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉、废菌丝体和酒糟水等；它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。无机氮源包括氨水、铵盐或硝酸盐等；微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称为迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH值的变化，若菌体代谢后产生酸性或碱性物质，则此种无机氮源称为生理酸性或生理碱性物质，正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH值有积极作用。例如在制液体曲时，用NaNO3的代谢而得到的NaOH可中和生长所释放出的酸，使pH值稳定在工艺要求的范围内。又如在另一株黑曲霉发酵过程中用（NH4）2SO4做氮源，培养液中留下的使pH值下降，而这对提高糖化型淀粉酶的活力有利。且较低的pH值还能抑制杂菌的生长，防止污染。氮源的主要功能是构成菌体成分，作为酶的组成成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。除玉米浆外，还有其他的一些原料如豆饼粉等，它们既能做氮源又能做能源。表2-14是工业上常用氮源及含氮量。

3.无机盐

无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值和氧化还原电位等。一般微生物所需要的无机盐为硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁、铁的化合物。还需要一些微量元素，如铜、锰、锌、钼、碘等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。

（1）磷酸盐　细胞中的矿质元素中磷的含量为最高，磷是合成核酸、磷酸、一些重要的辅酶NAD、NADP、CoA等及高能磷酸化合物（ADP、ATP）的重要原料。此外，磷酸盐还是磷酸缓冲液的组成成分，对环境中的pH值起着重要的调节作用。微生物所需要的磷主要来自无机磷化合物如K2HPO4、KH2PO4等。

磷酸盐在培养基中具有缓冲作用。微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01mol/L。工业生产上常用K3PO4·3H2O、K3PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。K3PO4·3H2O含磷13.55％，当培养基中配用1～1.5g/L时，磷浓度为0.0044～0.0066mol/L。Na2HPO4·12H2O含磷8.7％，当培养基中配用1.7～2.0g/L时，磷浓度为0.0048～0.00565mol/L。另外，玉米浆、糖蜜、淀粉水解糖等原料中还有少量的磷。磷酸含磷为3.16％，当培养基中配用0.5～3.7g/L时，磷浓度为0.005～0.007mol/L。如果使用磷酸，应先用NaOH或KOH中和后加入。

磷含量对谷氨酸发酵影响很大。磷浓度过高时，菌体转向合成缬氨酸；但磷含量过低，菌体生产不好。

（2）硫酸镁　镁是某些细菌的叶绿素的组成成分。虽并不参与任何细胞结构物质的组成，但它的离子状态是许多重要的酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂。如果镁离子含量太少，就会影响基质的氧化。一般革兰阳性菌对Mg2+最低要求量是25mg/L。革兰阴性菌为4～5mg/L。MgSO4·7H2O中含Mg2+9.87％，发酵培养基配用0.25～1g/L时，Mg2+浓度25～90mg/L。

硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分。硫是构成一些酶的活性基。培养基中的硫已由硫酸镁供给，不必另加。

4.特殊生长因子

生长因子是一类调节微生物正常代谢所必需的，但细胞自身不能合成的微量有机化合物。各种不同的微生物需要的生长因子各不相同。一般来说，生长因子包括维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶及其衍生物、卟啉及其衍生物、固醇、胺类以及脂肪酸等。一些微生物生长所需要生长因子的种类和用量见表2-15。

（1）维生素　维生素是一些微生物生长和代谢所必需的微量的小分子有机物。它们有以下特点：①机体不能合成，必须经常从食物中获得；②生物对它的需要量较低；③大多数是辅酶的组成结构，缺少维生素，酶就无法发挥作用；表2-16列出了一些在代谢中起重要作用的维生素。

（2）氨基酸　各种微生物对外源氨基酸的需要是不相同的，这取决于它们自身合成氨基酸的能力。凡是微生物自身不能合成的氨基酸一般需以游离氨基酸或小分子肽的形式供应。其中小分子肽往往比游离氨基酸更容易透入细胞，从而较快地为细胞所利用。提供外源氨基酸时，需注意维持各种氨基酸之间的平衡，因为在培养基中如果一种氨基酸的含量过高，会抑制其他氨基酸的摄取。因此在配制培养基时必须注意所添加的氨基酸的含量要控制在一定的浓度范围内，避免氨基酸之间因浓度不协调所产生的不良作用。

（3）嘌呤、嘧啶及其衍生物　这类生长因子的主要功能是构成核酸和辅酶。嘌呤和嘧啶进入细胞后，必须先转变成核苷和核苷酸才能被利用。核苷酸一般不能直接用来作为生长因子，因为核苷酸中的磷酸基团的存在会导致它们电离，从而难以透过细胞膜进入细胞。

（4）脂肪酸等　有些微生物不能合成脂肪酸等类脂，必须从外界摄取长链脂肪酸，用以构建细胞膜。此外，有些微生物还需要固醇、胆碱和肌醇等类脂，用于构建细胞膜。

能够提供生长因子的天然物质有酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或细胞浸液及微生物生长环境的提取液。也可以在培养基中加入已知成分和含量的复合维生素液（表2-17）。

生长因子的主要功能是提供微生物细胞重要化学物质（如蛋白质、核酸和脂质），作为辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。

各种微生物所需要的生长因子各不相同，有的需要多种，有的仅需要一种，有的不需要。一种微生物所需的生长因子也会随培养条件的变化而变化，如在培养基中是否有前体物质、通气条件、pH值和温度等条件都会影响微生物对生长因子的需求。

5.前体物质和促进剂

发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些添加的物质包括前体物质、抑制剂和促进剂（包括诱导剂、生长因子等）。

（1）前体物质　指某些化合物加入到发酵培养中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。有些物质如苯乙酸、丙酸等浓度过高对菌体会产生毒性。同时，菌体还具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为了减少毒性和提高前体的利用率，常采用少量多次加入的方法。总的加入量可按每一个产物分子中，进入几个前体分子，按等物质的量计算前体的加入量，在总加入量中还应考虑菌体氧化分解的那一部分前体。一些重要的前体物质的例子见表2-18。

（2）发酵过程中的促进剂和抑制剂　在发酵过程中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或刺激剂。例如在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。

在培养基中添加微量的促进剂可大大地增加某些微生物酶的产量。常用促进剂有各种表面活性剂（清洗剂、吐温80、植酸等）、乙二胺四乙酸、大豆油抽提物、黄血盐、甲醇等。

抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂（表2-19），常可促进抗生素的生物合成。在不同的情况下，不同的促进剂所起的作用也各不相同。①有的可能起生长因子的作用，如加入微量植物刺激剂可促进某些放线菌的生长发育，缩短发酵周期或提高抗生素发酵单位。②有的可推迟菌体的自溶，如巴比妥类药物能增加链霉素产生菌的菌丝抗自溶能力（巴比妥主要对链霉素生物合成酶系统具有刺激作用）。③有的是抑制了某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化。④有的是降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成，如在四环素发酵中加入硫氰化苄，可降低其产生菌在三羧酸循环中某些酶的活力，而增强戊糖代谢，使之利于四环素的合成。⑤有的可改变发酵液的物理性质，改善通气效果，如加入聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二乙胺等水溶性高分子化合物或加入某些表面活性剂后改善了通气效果，进而促进发酵单位提高。⑥有的可与抗生素形成复盐，从而降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成，如在四环素发酵中加入N，N'-二苄基乙二胺二乙酸（DBED）与四环素形成复盐，促使四环素向有利于合成的方向进行。

二、工业发酵培养基的类型和用途

（一）根据来源分类

根据来源，可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。

天然培养基是采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种植物、动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质（牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等）制成的，适合于多种类微生物的生长，而一般自养生物不能生长。合成培养基是使用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的，成分精确、重复性强，可以减少不能控制因素，适用于实验室范围作为有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析定量研究工作。半合成培养基为既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。

（二）按培养基物理性状分类

按培养基物理性状分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。

固体培养基比较适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类。如香菇、银耳等的生产。发酵工业上大规模的生产用固体培养基，其组成成分常用麸皮、大米、小米、木屑、谷壳和琼脂等，有的还另加一些其他营养成分。半固体培养基即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5％～0.8％，培养基即呈半固体状态，主要用于鉴定菌种，观察细菌运动性及噬菌体的效价滴定等。液体培养基80％～90％是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。

（三）按培养基的用途分类

按培养基的用途分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。

1.孢子培养基

孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是促进菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。其基本配制要求是：①营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子，如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐-其他盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5％酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子；②所用无机盐的浓度应适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色；③要注意孢子培养基的pH值和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基，大米培养基，玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少、疏松、表面积大，所以是较好的孢子培养基。大米培养基的水分控制在21％～25％较为适宜。在酒精生产中，当制曲（固体培养）时，曲料水分含量需控制在48％～50％，而曲房空气湿度需控制在90％～100％。

2.种子培养基

种子培养基（包括摇瓶种子和小罐种子培养基）：是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可含有较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH值，其组成还要根据不同菌种的生理特性而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以种子培养基中常包括发酵培养基有机及无机氮源。最后一级种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后迅速适应，快速生长。

种子培养基培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞，为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。

种子培养基的特点：必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子；种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源；种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

3.发酵培养基

发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑用分批补料来满足培养基条件。

发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。

需要注意以下问题。①根据产物合成的特点来设计培养基：对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。生产氨基酸等含氮化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。②发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。③发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。

发酵培养基的选择原则如下。①必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。②有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。③有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。④有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。⑤尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。⑥原料价格低廉，质量稳定，取材容易。⑦所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。⑧有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。

发酵培养基的设计和注意事项如下。①提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。②配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。③主成分与其他成分的配比。④控制合适的pH值：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要一定的pH环境，在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH值适合于微生物生长或产物合成所需。

pH值的具体控制方法如下。①可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH，但更应在配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分，使其pH值适合该微生物生长或合成代谢产物的需要。②还要注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况。③控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基pH波动太大的物质。④避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀。如葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。硫酸铵中的与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此两者也不宜直接配成培养基。⑤注意代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。如前体物质、诱导剂、阻遏物、抑制剂、金属离子。

添加诱导物：目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能获得高产。

注意阻遏物或抑制剂的影响：培养基中存在反馈阻遏物或分解阻遏物均能影响酶的合成，降低发酵产量。有些酶的抑制剂却能提高某些代谢产物的产量，最早利用抑制剂提高中间代谢物产量的例子是甘油发酵中加入亚硫酸钠。在培养基配制时必须注意加入有益的抑制剂，而避免混入有害的抑制物。

金属离子的影响：有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。

（四）根据主要成分或使用目的分类

根据主要成分或使用目的可分为基础培养基、增殖培养基、鉴别培养基和选择培养基。

1.基础培养基

含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，称为基础培养基。

2.增殖培养基

增殖培养基可以配制成适合某种微生物生长而不适合其他微生物生长，从而达到从自然界分离这种微生物的目的。

3.鉴别培养基

根据微生物能否利用培养基中某种营养成分，借助指示剂的显色反应，以鉴别不同种类的微生物。

4.选择培养基

选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要菌的生长，而促进某种需要菌的生长。

三、工业发酵培养基的选择和确定方法

不同的微生物对培养基的需求是不同的，因此，不同微生物培养过程对原料的要求也是不一样的。应根据具体情况，从微生物营养要求的特点和生产工艺的要求出发，选择合适的培养基，使之既能满足微生物生长的需要，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。

（一）选择原料的依据

1.原料选择的原则

选择淀粉质原料生产酒精时，从工艺的角度着眼，凡任何含有可发酵性糖或可变为发酵糖的原料，都可作为酒精生产的原料。对于工业上大规模投入生产的原料，除了要提出工艺上的要求外，还要提出生产管理和经济上的要求，因此，在选择工业上大规模生产酒精的原料时，应考虑到下列诸条件。

（1）因地制宜，就地取材，原料产地离工厂要近，便于运输，节省费用。

（2）要求原料内碳水化合物含量较多，蛋白质含量要适当，适合微生物的需要和吸收利用。

（3）原料资源要丰富，容易收集。由于酒精生产需要大量原料，要保证一定的库存量。

（4）原料要容易贮藏。应考虑到新鲜原料内含水量多，不耐久藏，最好选择经干燥后，含水极少的干原料，易于保藏，不易霉烂。

（5）对人民的身体无损害，影响发酵过程的杂质含量应当极少或者几乎不含。

（6）原料价格低廉，可降低产品成本。

此外，还应当考虑到大力节约粮食原料，尽量少用或不用粮食原料，充分利用当地的非粮食原料，广泛利用野生植物原料，同时利用农林副产物和植物纤维原料，以及亚硫酸盐纸浆废液等，对于节约粮食原料有着重要意义。另外，利用石油原料化学合成制造酒精，也是生产酒精的主要途径。

2.在确定原料选择原则时需注意的问题

（1）所选用的培养基与所使用的发酵器的结构有关。例如ICI公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。同样的理由，再要考虑培养基的组分的变化。

（2）培养基的组成，除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外，还要考虑到培养基的pH值变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等，而且还有前体和代谢抑制剂的需要。

（二）常用主要原料及其化学组成

1.原料的种类

发酵生产的原料，一般可分成下列几类。

（1）薯类　甘薯、马铃薯、木薯、山药等。

（2）粮谷类　高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。

（3）野生植物　橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香附子等。

（4）农产品加工副产物　米糠、米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。

2.常用原料的化学组成

原料所含的化学成分，不仅关系着生产率的高低，同时也影响着生产的工艺过程。常用原料中主要的化学成分如下。

（1）碳水化学物　原料中所含的淀粉或与淀粉类似的菊糖、蔗糖、麦芽糖、果糖及葡萄糖等，这些物质都可以发酵生成产品，同时也是霉菌和酵母的营养及能源，原料中含这些物质越多，生成酒精也就越多，所以它和产量有着密切的关系。碳水化合物中的五碳糖多存在于原料的皮层，如麸皮、高粱糠、谷糠、花生壳等都含有很多，它不但影响淀粉含量，而且发酵中也易生成有害的糠醛。纤维素虽属于碳水化合物，但不被淀粉水解，只起填充作用，对于发酵没有什么直接影响。

（2）蛋白质　原料含有的蛋白质，在发酵生产过程中，经蛋白酶水解后，成为微生物生长繁殖的重要营养成分，而微生物细胞中，30％～50％（干重）是蛋白质。一般来说，当培养基内氮的含量适当，则微生物生长旺盛，酶的含量也较高。有些原料所含蛋白质有时不能满足微生物生长和繁殖的要求，则应从外界加入氮源。氮源一般包括有机氮源和无机氮源两种，根据不同情况，添加不同种类的氮源。

（3）脂肪　对发酵有影响，如高粱糠、米糠等含油脂多，则生酸较快，生酸幅度也较大。一些发酵厂如采用玉米作为原料，总是把玉米坯芽除去。

（4）灰分　灰分中的磷、硫、镁、钾、钙等是构成菌体细胞和辅酶的重要成分，还有调节渗透压的作用，是微生物生长不可缺少的，在一般原料中，灰分的含量足够。

3.培养基的确定方法

（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。

其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

（2）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验；然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH值变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH值，不断调整配比来适应上述各种情况。

（3）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，首先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH值可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。

（4）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。

（5）根据生产和科学研究的需要选择培养基。工业上，液体深层培养具有占地面积小、发酵效率高、操作方便、易于机械化和自动化生产、降低劳动强度等优点。所以，发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行液体发酵，并根据微生物对氧气的要求，分别作表面静止培养或深层通气培养。实验室或制种车间进行固体培养常采用试管、扁瓶和培养皿。工业生产中也常采用固体原料，如小米、大米、麸皮、马铃薯等直接制作斜面，或在茄子瓶表面培养霉菌、放线菌。具有设备简单、投资少、易推广等优点。大规模生产中，固体培养的缺点是占地面积多，劳动强度大，生产稳定性差。

（6）根据经济效益选择培养基原料。考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用方向主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖。同时，使用稀薄的培养基，适当减少碳氮配比。石油作为碳源的微生物发酵可以生产以粮食为碳源的发酵产品。有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料。代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，货源充足，价格低廉，便于就地取材，方便运输。

四、原料预处理的方法

（一）原料除杂

1.筛选、风选

气流-筛式分离机主要用于谷物原料除杂。凡是厚度和宽度或空气动力学性质（悬浮速度）与所用谷物不同的杂质，都可用气流-筛式分离机将其分离。

2.磁力除铁

磁力除铁包括永久性磁力除铁器和电磁除铁器两种。

（二）原料的粉碎

1.原料粉碎的目的

把原料进行粉碎后成为粉末状原料，其目的是要增加原料受热面积，有利于淀粉颗粒的吸水膨胀、糊化，提高热处理效率，缩短热处理时间。另外，粉末状原料加水混合后容易流动输送。对于一些带壳的原料，如高粱、大麦，在粉碎前，则要求先把皮壳破碎，除去皮壳后再行粉碎。

固体物料的粉碎（图2-6）按其受力情况可分为：

（1）挤压粉碎（a）；

（2）冲击粉碎（b）；

（3）研磨粉碎（c）；

（4）剪切粉碎（d）；

（5）劈裂粉碎（e）。

2.粉碎方法

原料粉碎的方法可分为干粉碎和湿粉碎两种。

（1）干粉碎

①粗碎　原料过磅称重后，进入输送带，电磁除铁后进行粗碎。粗碎后的物料应能通过6～10mm的筛孔，然后再送去进行细粉碎。

粗碎常用的设备是轴向滚筒式粗碎机，也可用锤式粉碎机进行粗碎。

②细碎　经过粗碎的原料进入细碎机，细碎后的原料颗粒一般应通过1.2～1.5mm的筛孔。也有采用1.8～2.0mm筛孔的。常用的细碎设备是锤式粉碎机。

（2）湿粉碎　当采用湿粉碎时，将蒸煮所需的全部水量和原料一起加入粉碎机中，这种方法可以加工水分较多的原料，原料粉末不会飞扬，减少了原料的损失，省去了灰尘通风设备，但是湿粉碎所得到的粉碎原料，应立即直接用于生产。因其不易于贮藏，且耗电量较干粉碎多8％～10％，同时锤式粉碎机容易产生堵塞现象。

3.常用的粉碎设备

（1）锤式粉碎机的结构示意图见图2-7。

（2）辊式粉碎机（适用于麦芽、大米粉碎）结构示意图见图2-8。

根据生产实践，扎辊长度为100mm的两辊式粉碎机每小时可粉碎麦芽150～200kg，四辊式可达200～300kg。一般每小时粉碎1000kg的生产量功率消耗约为2kW。

（三）原料的输送

1.机械的输送

为了物料能起到混合搅拌和输送作用，固体输送主要是采用机械输送。发酵厂内固体输送大多采用皮带输送机，斗式提升机和螺旋混合器（也称绞龙）。如果在绞龙上加盖铁板，则在密闭系统内进行物料输送，对粉状物料而言，可以防止运转时粉尘的飞扬。

2.气流输送

气流输送又称风送，或称气力输送。它是利用空气流动所产生的推动力在管道中输送的，其简单原理是，固体物料在垂直向上的气流中，受到向下拉的重力F1和气流向上推的动力F2，如果F2大于F1，则气流向上推动，使物料由低位向高位运送。例如甘薯干的块状原料，利用风动运送，由引风机把甘薯干运进料管，从低位向高位运送上去，而原料中的铁皮、石块等杂物，因比重较大，不能为气流所带走，而自动掉落在地上。风送特别适于输送散粒状或块状的物料，是一种较好的输送方式。

第五节　淀粉水解糖的制备

一、淀粉水解的理论基础

1.淀粉颗粒的外观

淀粉颗粒呈白色，不溶于冷水和有机溶剂，其内部呈复杂的结晶组织。随原料品种和种类的不同，淀粉颗粒具有不同的形状和大小。形状不规则，大致上可分为圆形、椭圆形和多角形。

一般说来，水分含量高、蛋白少的植物，颗粒较大，形状较整齐，大多为圆形或卵形，如马铃薯、甘薯的淀粉。

颗粒较大的薯类淀粉较易糊化，颗粒较小的谷物淀粉相对较难糊化。

淀粉颗粒的构成如下：

2.淀粉的分子结构

淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉通过α-1，4键连接。支链淀粉的直链部分通过α-1，4键连接，分支点则由α-1，6键连接，支链平均有25个葡萄糖基团，因而还原性末端数量较少。一般植物中直链淀粉含量为20％～25％，支链淀粉占75％～80％。直链淀粉在70～80℃的水中可溶，溶液的黏度较小，遇I2呈纯蓝色；支链淀粉在高温水中可溶，溶液的黏度大，遇I2呈蓝紫色。

3.淀粉在水-热处理过程的中变化

（1）水-热处理的概念　将淀粉质原料与水一起，在高温高压或低温低压的条件下进行处理的过程。

（2）水-热处理的目的　淀粉原料经过水热处理，使淀粉从细胞中游离出来，并转化为溶解状态，以便淀粉酶系统进行糖化作用，这就是原料水-热处理的主要目的。

（3）淀粉的膨胀和溶解

①膨胀　淀粉是一种亲水胶体，遇水加热后，水分子渗入淀粉颗粒的内部，使淀粉分子的体积和重量增加，这种现象称为膨胀。

②糊化　在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的黏稠液体的现象，称为淀粉的糊化（图2-9）。此时的温度称为糊化温度。

③溶解或液化　淀粉糊化后，如果提高温度至130℃，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的黏度迅速下降（图2-10），变为流动性较好的醪液，这种现象称为淀粉的溶解或液化。

（4）淀粉质原料的各个组分在水-热处理过程中的变化

①淀粉的变化

a.自糖化　在50～60℃预煮时，原料自身的淀粉酶系统活化，并分解淀粉生成糖和糊精。

b.酸水解　在微酸条件（pH值5.6～6.3），淀粉的局部酸水解现象。

在70℃以下，水解的产物是糖，75～80℃产物是糊精。

②糖的变化

a.己糖的变化（葡萄糖和果糖）　果糖在酸性介质中不稳定，由于容易开链，所以较易分解。部分的5-羟甲基糖醛缩合生成黄棕色色素。葡萄糖在pH值2～4稳定性最佳。

b.戊糖的变化　蒸煮过程中戊糖和己糖一样脱水生产糠醛，但是后者比羟甲基糠醛稳定。

c.焦糖化　当温度达到糖的熔点时（185℃），糖分脱水形成黑色无定形物，统称焦糖。焦糖不仅不能被发酵利用，而且还会阻碍糖化酶对淀粉的糖化作用，影响微生物的生长。焦糖化反应在高浓度醪液中比低浓度中较易进行。在不易与溶液接触的地方（如蒸煮锅的死角）或锅壁局部过热处都容易发生。

d.氨基糖反应　还原糖与氨基酸之间产生的呈色反应称为氨基糖反应。氨基糖反应不是一个简单的聚合反应，而是一个过程相当复杂的反应。

二、淀粉的液化（糊化）

1.淀粉液化的方法

（1）按水解动力不同分为：酸法、酶法、酸酶法、机械液化法。

（2）按工艺的不同分为：间歇式、半连续式、连续式。

（3）按设备的不同分为：管式、罐式、喷射式。

（4）按加酶方式的不同分为：一次加酶、两次加酶、三次加酶。

（5）按原料的精粗不同分为：淀粉质原料直接液化、精制淀粉液化。

2.酶法液化

（1）酶解法液化、糖化淀粉常用的酶

①α-淀粉酶　其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖。对淀粉的作用，可将长链从内部分裂成若干短链的糊精，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，遇碘呈色很快反应，表现如下：

蓝→紫→红→浅红→不显色（即碘原色）

②糖化酶　作用于淀粉的1，4键结合，能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断，因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。

③β-淀粉酶　β-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，不能水解α-1，6糖苷键，遇此键水解停止，也不能越过继续水解。水解由淀粉分子的非还原末端开始，水解相隔的α-1，4键麦芽糖，届于β-构型，故叫β-淀粉酶。β-淀粉酶届于外切酶，水解产物只有麦芽糖。

④异淀粉酶　异淀粉酶能水解支链淀粉和糖原分子中支叉地位的α-1，6糖苷键，使支叉结构断裂。但对于直链结构中的α-1，6糖苷键却不能水解。

⑤普鲁蓝酶　能水解支叉结构和直链结构的α-1，6糖苷键、支链淀粉、糖原和其β-极限糊精及普鲁蓝分子中的β-1，6键。异淀粉酶或普鲁蓝酶与β-淀粉酶合并水解，能使支叉开裂，使β-淀粉酶继续水解，大大提高麦芽糖的产率。

（2）酶法液化方法

①间歇　（升温）液化法

工艺：将浓度30％～40％淀粉乳调整pH值到6.5，加入CaCl2（0.01mol/L）和一定量淀粉酶（5～8U/g淀粉），剧烈搅拌，加热到85～90℃，保持30～60min，达到所需的液化程度（DE15％～18％），升温到100℃，灭酶10min。

优点：此方法简便。

缺点：效果较差，能耗大，原料利用率低，过滤性能差。

②半连续　（高温）液化法（喷淋连续进出料液化法）

工艺：将淀粉乳调整到适当pH值和Ca2+浓度，加入一定量的液化酶，用泵打给喷淋头引入液化罐中（其中已有90℃热水），淀粉糊化后，立即液化，置保温罐，90℃保温40min，达到所需的液化程度。

优点：设备和操作简单，效果比间歇液化好。

缺点：不安全，蒸汽耗量大，温度无法达到最佳温度，液化效果差，糖液过滤性能也差。

③连续　（喷射）液化法

利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层，以短时间达到要求的温度，完成糊化和液化。喷射后，进入保温罐，85～90℃保温45min。

优点：设备小，便于连续操作，原料利用率高，转化率高，蛋白质凝聚好。

缺点：但要求一定压力的蒸汽，进出料的速度要稳定。

喷射液化的几种流程如下。

a.一段高温喷射液化工艺：

工艺控制要点：淀粉乳浓度30％左右；pH值6.0～6.5；喷射器出口温度（105±3）℃；保温97～100℃，30～60min。

（a）单罐维持，见图2-11。

（b）连续出料，见图2-12。

b.多段液化　多次加酶，多次加热，适用各种原料（特别是难液化的小麦、玉米淀粉），见图2-13。

（3）液化程度的控制

①I2试。

②测定DE值

a.DE值高，糊精太小，不利于糖化酶作用，影响催化效率，终点DE值低。

b.DE值低，液化不彻底，糖化速度慢，酶用量大，时间长，过滤性能差。

③透光率和澄清度。

（4）液化效果的标准

①液化要均匀。

②蛋白絮凝效果好。

③液化彻底（60℃时液化液要稳定，不出现老化现象，不含不溶性淀粉颗粒，液化液透明、清亮）。

三、淀粉的糖化

（一）糖化理论

1.基本概念

（1）糖化　以无机酸或酶为催化剂，在一定温度下使淀粉水解，将淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵性糖的过程。

（2）糖化剂　糖化过程中所用的催化剂。包括无机酸和酶。

（3）理论收率　（111.11％）

（3）实际收率　（105％～108％）

（4）淀粉转化率

（5）DE值　糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计）占干物质的百分率，用以表示淀粉糖的糖组成。

还原糖用斐林法或碘量法测定，干物质用阿贝折光仪测定。

2.糖化的目的

将淀粉转化为可发酵性糖。

3.淀粉的水解反应过程

淀粉分子内α-1，4和α-1，6葡萄糖苷键的断裂，相对分子质量逐渐变小，依次变为糊精，低聚糖，麦芽糖和葡萄糖。糊精是若干种分子大于低聚糖的碳水化合物，一般含2～10葡萄糖单位的为低聚糖。糊精具有旋光性，还原性，能溶于水，不溶于酒精。与碘作用，聚合度不同颜色不同。葡萄糖聚合度与碘液的呈色表见表2-20。

4.糖化的过程检测

（1）检验液化　是否有淀粉，用碘液，是否呈蓝色。

（2）检验糖化　是否水解完全。

①测定还原糖。

②用无水酒精。

5.淀粉水解过程的反应

（1）主反应　糖化（水解作用）。

（2）副反应

①复合反应　在酸和热作用下，部分葡萄糖经1，6键结合成龙胆二糖，异麦芽糖和其他低聚糖。

②分解反应　葡萄糖分解为羟甲基糠醛、有机酸和有色物质等非糖产物。

（二）淀粉糖化的方法

1.酸解法

（1）定义　以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。

（2）优点　工艺简单，设备较单一，水解时间短，设备周转快。

（3）缺点　需耐高温、高压和耐腐蚀的设备；副产物多，淀粉的转化率低；对原料要求高；废水难处理。

（4）酸解法中常用的酸

①盐酸　高效，但中和后产生氯化物，增加糖液灰分，对葡萄糖的结晶、分离及收率会有影响。

②硫酸　能力仅次于盐酸，用碳酸钙中和，经脱色、离子交换可除去。

③草酸　能力低，用石灰中和生成草酸钙，脱色过滤易除去，非强酸，减少了复合反应。

（5）淀粉酸解的工艺流程见图2-14。

（6）淀粉酸解的工艺参数

①淀粉浆的pH值　1.5左右。

②水解压力　2.5～2.6atm（1atm=101325Pa）。

③水解时间　30min。

④一次中和pH值　4.8～5.0。

⑤二次中和pH值　6.7～7.0。

（7）影响淀粉酸解速度的因素

①酸的种类与用量。

②水解的温度与压力。

③淀粉乳浓度的高低。

2.酶解法

（1）定义　以酶为催化剂，在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。包括液化和糖化两个过程，故又称双酶水解法。

（2）优点　反应条件温和；副反应少，淀粉质量高；可在较高淀粉浓度下水解，对预料要求不高；糖液的质量高、营养物质较丰富。

（3）缺点　水解时间长，夏天糖液容易变质；设备较多。

（4）酶法糖化的工艺流程

液化→糖化→灭酶→过滤→贮糖计量→发酵

（5）工艺要点

①糖化pH值4.2～4.5。

②温度60℃左右。

③糖化酶用量150U/g淀粉。

④糖化时间32h，用无水酒精检验无糊精存在时，糖化结束，然后将pH值调整至4.8～5.0，维持20min灭酶。

3.糖化方法的比较

①水解时间　酸解法短，酶解法长。

②水解程度　酶解法高。

③糖液杂质　酶解法低，酸解法高。

4.水解糖液的质量要求和控制要点

（1）水解糖液的质量要求

①色泽　呈强黄色透明液。

②糊精反应　无。

③还原糖含量　18％左右。

④DE值　90％以上。

⑤透光率　60％～80％（650nm）。

⑥pH值　4.6～4.8。

⑦淀粉转化率　92％以上（实际产量/理论产量）。

（2）水解糖液质量的控制要点　合理控制淀粉乳浓度，糖液要清，糖液要新鲜，糖液贮存容器一定要保持清洁，定期清理和清洗，防止酵母菌等浸入。

5.啤酒酿造中的糊化、糖化

在啤酒酿造中，糖化过程是指辅料的糊化醪和麦芽中淀粉受到麦芽中淀粉酶的分解，形成低聚糊精和以麦芽糖为主的可发酵性糖的全过程。

6.啤酒酿造的糖化设备

（1）糊化锅的结构与相关参数　糊化锅是用于加热煮沸大米或其他辅料粉和部分麦芽粉醪液，使淀粉糊化和液化的设备。我国行业标准QB/T 3683—1999（糊化锅）。

锅体型式：见图2-15，由圆柱形锅身，球形底或圆锥形底和弧形顶盖或锥形顶盖组成。锅身直径与高度之比为（1.5～2）:1，有效容量系数58％～60％，锥底角度以α<120°为宜。

加热方式：夹套间接蒸汽加热，夹套蒸汽压力为0.3～0.6MPa。

升温速度：不低于1.5℃/min。

搅拌装置：为了防止物料粘锅和提高传热效果，在靠近锅底处设有桨式搅拌器。搅拌器的转速一般在20～50r/min，圆周速度3～4m/s。

材质：锅身、锥底和顶盖宜采用不锈钢。球底宜采用紫铜。

净空高度：不小于500mm。

排气管截面积与锅身截面积之比：1:（30～50）。

需设附件：入孔门，照明灯，液位、温度测量装置，清洗装置，安全装置，排气管蝶阀。

表面要求：锅盖、锅身和锅底内表面焊缝应磨平抛光，应作耐腐蚀的酸性钝化处理。外露表面抛光，不应有碰伤、划伤痕迹。

（2）糖化锅型式与结构　与糊化锅型式与结构相似，以不锈钢制造圆筒形的锅身，球形、椭球形或锥形夹套式底，弧形或锥形顶盖。夹套内用直接蒸汽加热，夹套能耐0.15～0.25MPa压力，锅内夹底为了强化传热较多采用紫铜板。锅底部设有桨叶式搅拌器，搅拌器由电机通过立式涡轮减速箱，直接带动搅拌桨叶旋转。锅顶有一排气管（升汽管）。

第六节　糖蜜原料的处理

一、糖蜜的来源与特点

1.来源

①甘蔗糖厂的副产物。

②甜菜糖厂的副产物。

2.特点

（1）糖蜜中干物质的浓度很大，在80～90°Bx。

——含糖分50％以上。

——含5％～12％的胶体物质。

——含灰分10％～12％。

（2）糖蜜中一般含有大量杂菌，主要为产酸细菌。

（3）重金属离子，主要是钙、铅等离子，对微生物会有抑制。

（4）糖蜜中除了糖之外，还含有含氮化合物，氨基酸，维生素。

二、糖蜜前处理的方法

①加酸通风沉淀法。

②加热加酸沉淀法。

③添加絮凝剂澄清处理法。

第七节　前体物质、抑制剂和促进剂

发酵培养基中某些成分的加入不促进微生物的生长，只是有助于调节产物的形成，这些添加的物质包括前体物质，抑制剂和促进剂。

一、生物合成的前体物质

生物合成的前体物质指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产量却因前体的加入有较大提高。具体见表2-21。

①产量并不比其他技术高。

二、抑制剂

加入后会抑制某些代谢途径的进行，使另一途径活跃，从而获得人们所需要的某种代谢产物，或使正常代谢的某一代谢中间物积累。

最初应用于甘油发酵，抗生素工业应用最多，见表2-22。

三、促进剂

促进剂是指那些既不是营养物，又不是前体，但能提高产量的添加剂，如酶生产中的诱导物或表面活性剂等。

诱导剂能增加细胞的产酶速度，提高产酶量，但不能从根本上改变细胞原有的蛋白质模板，包括酶的底物，底物类似物，及被转化为诱导物的前体物质，见表2-23。

表面活性剂（洗涤剂、吐温等）：可以增加酶的产量，机制不十分清楚，一般认为是因为：

（1）改变了细胞膜的通透性；

（2）同时增强了氧的传递速度，改变了菌体对氧的有效利用。

第八节　微生物菌种生长条件

菌种的培养条件包括温度、pH值、氧、种龄、接种量等。

一、温度

温度对微生物生长的影响很大，通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度是影响微生物生长的最重要的环境因素之一，温度直接影响其生长和合成酶。

温度主要通过影响微生物细胞膜的流动性和生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。随着温度的升高，细胞内酶促反应速度加快，代谢和生长也相应加快。同时，温度增高易导致胞内各种生物活性物质变性，细胞功能下降，甚至导致细胞死亡。所以各种微生物都有3种基本温度：最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度。

最低生长温度是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。处于这个温度条件下的微生物生长很缓慢，若低于这个温度则完全停止生长。不同微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质的物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而改变。

最适生长温度是指微生物生长繁殖速度最快的温度。不同微生物的最适生长温度不一样。

最高生长温度是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度之下，微生物细胞易于衰老和死亡，高于此温度，微生物不可能生长。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。

不同微生物生长的温度上限不同，真核生物生长的温度上限在60℃左右，其中动植物的温度上限更低。如果超过了最高生长温度则会导致微生物死亡。这种致死微生物的最低温度界限，称为致死温度。致死温度与处理时间有关。在一定温度下处理的时间越长，死亡率越高。不同微生物的致死温度不同（表2-24）。

多数细菌的营养细胞和病毒，在50～60℃条件下10min可致死；嗜热脂肪芽孢杆菌的抗热性很强，121℃经12min才能死；少数动物病毒也具有较强的抗热性，如脊髓灰质炎病毒在75℃条件下30min才致死；噬菌体比其宿主细胞耐热，一般在65～80℃失活。放线菌和霉菌的孢子比营养细胞耐热，76～80℃条件下10min才能被杀死。细菌的芽孢抗热性最强，通常100℃以上处理相当长时间才能致死（表2-25）。

不同微生物，其最适宜生长温度和耐受温度范围各异。如图2-16所示，嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌和嗜高温菌的最适生长温度分别为18℃、37℃、55℃和85℃左右，其共同特点是：其适应力在比最适温度低的温度范围要强于高温度范围；其生长温度的跨度为30℃左右。

总之，微生物的重要组成如蛋白质、核酸等都对温度较敏感，随着温度的增高有可能遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，总体说在-10～95℃。任何微生物的生长都需要有最适生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长和繁殖，这对生产有很大的好处，即可减少污染杂菌的机会和夏季培养所需降温的辅助设备，因此培养耐高温的菌种有一定的生产现实意义。

二、pH值

培养基中的pH值与微生物生命活动有着密切的关系，各种微生物有其可以生长的和最适生长的pH值范围。微生物通过其活动也能改变环境的pH值。pH值是微生物生长和产物合成的非常重要的状态参数，因此，必须掌握发酵过程中pH值变化的规律，及时监控，使它处于生产的最佳状态。大多数微生物生长适应的pH跨度为3～4个pH单位，其最佳生长pH跨度在0.5～1。不同微生物的生长pH最适宜范围不一样，细菌和放线菌在6.5～7.5，酵母在4.5～5.5，霉菌在4.5～5.5。其所能忍受的pH上下限分别为：5～8.5，3.5～7.5和3～8.5；但也有例外。pH值影响膜的通透性。一般而言，生长最适宜温度高的菌种，其最适pH值也相应高一些。可由此设计微生物生长的最适宜条件（温度、pH值），控制杂菌的生长。

发酵过程中，控制发酵液的pH值是控制生产的指标之一，pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累。各种微生物的正常生长都需要有合适的pH值，一般霉菌和酵母菌比较适合微酸性环境，放线菌和细菌适于各种中性或微碱性环境。为此，当培养基配制好后，若pH值不合适，必须加以调节。当微生物在培养过程中改变培养基的pH值而不利于本身的生长时，应以微生物菌体对各种营养成分的利用速度来考虑培养基的组成，同时加入缓冲剂，以调节培养液的pH值。控制pH值不但可以保证微生物良好的生长，而且可以防止杂菌的污染。

三、氧

微生物对氧的需要不同，是由于依赖获得能量的代谢方面的差异。好气性菌主要是有氧呼吸或氧化代谢，厌气菌为厌氧发酵（分子间呼吸），兼性厌气菌则两者兼而有之。

在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面。

（1）培养基的成分和浓度影响　培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随着增大。

（2）菌龄影响　耗氧呼吸旺盛时，耗氧量大。发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧量自然减弱。

（3）发酵条件影响耗氧　在最适宜的条件下发酵，耗氧量大。

（4）有毒代谢产物影响　发酵过程中，排除有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。

由于氧在水中的溶解度很低，从而使溶解氧往往成为最易控制因素，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。随着高产菌株的广泛应用和丰富培养基的采用，对氧气的要求更高。即使培养基是被空气饱和，它所贮存的氧量仍然是很少的，在发酵旺盛时期，一般也只能维持正常呼吸15～30s，其后微生物的呼吸就会受到抑制。在对数生长期即使发酵液中的溶解氧能达到100％空气饱和度，但是若此时中止供氧，发酵液中溶解氧在几分钟之内便耗竭，使溶解氧成为限制因素。氧是一种难溶于水的气体，空气中的氧在纯水中的溶解度更低。培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要低。这就决定了大多数微生物深层培养需要适当的通气条件，才能维持一定的生产水平。在28℃，氧在发酵液中的100％空气饱和浓度只有7mg/L左右，比糖的溶解度小7000倍。

四、通风和搅拌

通气可以供给大量的氧，通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。通气量的多少，最好由氧溶解的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长和合成酶。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。

搅拌则能使新鲜氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致，还有利于营养物质和代谢物的分散。此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。

一般来说，若培养罐深，搅拌转速大，通气管开孔小或多，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定的情况下，培养基的黏度越小，氧的溶解速度就越大。

搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，液膜表层的酶容易氧化变性，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。

五、种龄与接种量

1.种龄

种子培养时间称为种龄，在种子罐内，随着培养时间延长，菌体量逐渐增加。但是菌体繁殖到一定程度不同，由于营养物质消耗和代谢产物积累，菌体量不再继续增加，而是逐渐趋于老化。由于菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的控制就显得非常重要。在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。如果种龄控制不适当，种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。

最适种龄因菌种不同而有很大的差异。细菌的种龄一般为7～24h，霉菌种龄一般为16～50h，放线菌种龄一般为21～64h。同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到的种子质量也不完全一致，因此最适的种龄应通过多次试验，特别要根据本批种子质量来确定。种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。

2.接种量

接种量的大小直接影响发酵周期。生产上一般采取大接种量，一方面可以缩短发酵罐中菌体繁殖至高峰所需的时间，使产物合成速度加快，提高设备利用率；另一方面节约了发酵培养的动力消耗，并有利于减少染菌机会。

［知识链接］

［课堂互动］

［案例分析］

［思考题］

1.氮源有什么作用？常用的微生物氦源物质有哪些？

2.异养微生物的能源物质与自养微生物的能源物质是否相同？为什么？

3.什么是生长因子？它包括哪几类物质？它们的作用是什么？是否任何微生物都需要生长因子？如何满足微生物对生长因子的需要？

4.举例说明微量元素在生理上的重要性。

5.微生物的营养类型有哪几种？划分的依据是什么？举出各种营养类型的几个代表菌。

6.营养物质进入细胞的方式有哪几种？各有何特点？试比较它们的异同。

7.工业发酵培养基的主要成分有哪些？

8.培养基的类型有哪些？如何选择培养基？

9.如何配制培养基？分析所含物质对微生物起何作用？