二、液相色谱技术在食品安全领域的应用

（一）婴幼儿食品中维生素K1的测定（参考GB 5009.158—2016）

1.背景简介

维生素K是具有叶绿醌生物活性的一类物质。有维生素K1、维生素K2、维生素K3、维生素K4等几种形式，其中维生素K1为从绿色植物中提取的维生素，是天然存在的脂溶性维生素，在日常食品中广泛存在，维生素K2为肠道细菌（如大肠杆菌）合成的维生素。维生素K与肝脏合成四种凝血因子（凝血酶原、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ及凝血因子Ⅹ）密切相关，一旦缺乏维生素K，则肝脏合成的上述四种凝血因子为异常蛋白质分子，它们催化凝血作用的能力就会下降。而且维生素K是谷氨酸γ-羧化反应的辅助因子，维生素K的缺乏会导致上述凝血因子的γ-羧化无法正常进行，从而出现凝血时间延长，严重者会流血不止，甚至死亡。通常情况下，成人每日对维生素K的需求量为60～80μg。由于该类物质在食品中广泛存在，且体内肠道细菌也能合成，一般不会缺乏，但对于新生儿而言，由于维生素K无法通过胎盘，且新生儿肠道内无细菌，食品摄入种类单一，可能会出现维生素K的缺乏症。但是由于维生素K摄入过量也会导致贫血等症状，所以，食品安全国家标准——婴儿配方食品（GB 10765—2010）中规定了维生素K1含量为1.0～6.5μg/100kJ。因此，为了保障婴幼儿食品的质量，保护婴幼儿的健康，有必要对相应食品中的维生素K含量进行检测。

2.方法的选择

鉴于食品中的维生素K大多为来自植物源产品的维生素K1，故检测时主要针对维生素K1。目前，食品中维生素K1的测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、HPLC法和LC-MS/MS法等。其中分光光度法和薄层色谱法的分析过程烦琐，测定精密度较差，只适合粗略的分析，无法准确定性定量，应用极少。HPLC和LC-MS/MS是当前食品中维生素K1测定的主流方法，两者的灵敏度和定量能力均可满足测定的要求，LC-MS/MS虽然在定性分析上更为出色，但其价格较为昂贵，在应用的推广上不如HPLC，所以在食品中维生素K1的检测领域，HPLC法的应用更为普遍。

HPLC法检测维生素K1时可以采用多种检测器，如紫外检测器、二极管阵列检测器和荧光检测器等，但荧光检测器的灵敏度更高，因此GB 5009.158中第一法选择了液相色谱配荧光检测器进行检测。该方法对于婴幼儿食品及乳品、植物油中维生素K1的定量限为5μg/100g。样品首先经脂肪酶和淀粉酶酶解，由正己烷提取样品中的维生素K1，借助C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，由锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。

3.提取方法

对于米粉、奶粉等粉状样品，经混匀后直接取样；对于片状、颗粒状样品，经样本粉碎机磨成粉，贮存于样品袋中备用；对于液态乳、植物油等液态样品，摇匀后直接取样。

称取试样1～5g（精确到0.01g，确保维生素K1含量不低于0.05μg）于50mL离心管中，加入5mL温水溶解（液体样品直接吸取5mL，植物油不需加水稀释），加入5mL pH8.0的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的样品可以不加淀粉酶），加盖，涡旋2～3min，混匀后置于（37±2）℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。

取出酶解好的试样，分别加入10mL乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10mL正己烷和10mL水，涡旋或振荡提取10min，6000r/min离心5min，或将酶解液转移至150mL的分液漏斗中萃取提取，静置分层（如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象）。转移上清液至100mL旋蒸瓶中，向下层液再加入10mL正己烷，重复操作一次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。

将上述正己烷提取液旋蒸至干（如有残液，可用氮气轻吹至干），用甲醇转移并定容至5mL容量瓶中，摇匀，0.22μm滤膜过滤，滤液待进样。

注意事项：由于维生素K1易分解，整个前处理过程尽量避免紫外光直射，并尽可能避光操作。可直接购买商品锌还原柱，也可自行装填。装柱时，应连续少量多次将锌粉装入柱中，边装边轻轻拍打，以使装入的锌粉紧密。锌还原柱接入仪器前，须将液相色谱仪所用管路中的水排干。

4.液相色谱检测方法

采用C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）和锌还原柱（4.6mm×50mm）。流动相由900mL甲醇与100mL四氢呋喃混合组成，并含0.3mL冰醋酸、1.5g氯化锌和0.5g无水乙酸钠。流速为1mL/min。荧光检测器的激发波长为243nm，发射波长为430nm，进样量为10μL。在相同色谱条件下，将制备的空白溶液和试样溶液分别进样，进行高效液相色谱分析。以保留时间定性，峰面积外标法定量（图1-29）。

5.定量结果计算

依据标准系列溶液所得的标准曲线对试样溶液中目标物的质量浓度进行计算，按照如下公式计算最终样品中目标物的含量：

式中　X——试样中维生素K1的含量，μg/100g；

ρ——由标准曲线得到的试样溶液中维生素K1的浓度，ng/mL；

V1——提取液总体积，mL；

V2——分取的提取液体积（婴幼儿食品和乳品、植物油V1=V2），mL；

V3——定容液的体积，mL；

100——换算系数；

m——试样的称样量，g；

1000——将浓度单位由ng/mL换算为μg/mL的换算系数。

6.应用特点

与紫外检测器及二极管阵列检测器相比，采用荧光检测器的检测灵敏度更高，特异性更强。整体而言，本方法准确，灵敏度高，流动相体系简单，对仪器要求不高，可以满足对维生素K1的检测需求。其结果对维生素K1的研究具有直接指导作用，为人群维生素K1的营养状况提供基础数据。

（二）水产品中甲氧苄啶残留量的测定（参考GB 29702—2013）

1.背景介绍

甲氧苄啶（trimethoprim，简称TMP）为广谱抗菌药，抗菌谱与磺胺药类似，有抑制二氢叶酸还原酶的作用，但细菌较易对其产生耐药性，所以甲氧苄啶通常不单独作为抗菌药使用，常与磺胺类药物同时使用。研究表明，甲氧苄啶与磺胺药合用可使抗菌作用增强数倍至数十倍。目前，该品主要作为磺胺类药的增效药在养殖产业中广泛应用，可治疗水生动物的竖鳞、赤皮、烂鳃、疥疮等细菌性疾病，也可治疗禽类大肠杆菌引起的败血症、鸡白痢、禽伤寒、霍乱、呼吸系统继发性细菌感染和球虫病等。但由于其会在水产品体内产生药物残留，通过食物富集，继而危及人体健康，国内外都制定了严格的限量标准，欧盟和我国均规定在鱼类肌肉和皮中甲氧苄啶的最大残留限量为50μg/kg。

2.方法的选择

常用的甲氧苄啶检测方法有微生物检验法、酶联免疫检测法、HPLC和LC-MS/MS法等。其中微生物法是一种初筛方法，不能具体区分残留抗生素的种类；酶联免疫法虽然检测灵敏度高，但存在干扰和假阳性，且定性较为困难；LC-MS/MS定性、定量准确，但操作和维护费用高，推广普及率不高；而液相色谱法操作简单，定量准确，分离能力强，目前在甲氧苄啶的实际检测中应用最为广泛。

GB 29702—2013采用HPLC法对鱼（包括鳗鲡）、虾、蟹和龟鳖等水产品可食组织中甲氧苄啶的残留量进行检测，方法的定量限为20μg/kg。该法用三氯甲烷和酸性甲醇溶液提取样品中的甲氧苄啶，再以二氯甲烷反萃取，由混合强阳离子交换固相萃取（MCX）柱净化，高效液相色谱-紫外测定，外标法定量。

3.提取方法

称取约5g试样（精确至0.01g），置于50mL具塞离心管中，加入15mL三氯甲烷、14mL甲醇、6mL 0.1mol/L硫酸溶液，涡旋混合2min，4000r/min离心3min，取上清液于150mL分液漏斗中。残渣中加甲醇14mL和0.1mol/L硫酸溶液6mL，重复提取一次，合并两次上清液于分液漏斗中；加2mol/L氢氧化钾溶液2mL、二氯甲烷30mL，振摇2min，静置分层，取下层液于茄形瓶中，分液漏斗中加二氯甲烷30mL重复提取一次，合并两次下层液；于40℃旋转蒸发至近干，用5%乙酸溶液6mL溶解残余物，待净化。

MCX阳离子交换柱依次用甲醇6mL和5%乙酸溶液6mL活化，取备用液过柱，用5%乙酸溶液6mL和甲醇6mL淋洗，用氨水甲醇溶液15mL洗脱，于40℃旋转蒸发至近干，用流动相1.0mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。

4.液相色谱检测方法

采用ZORBAX-C18色谱柱（250mm×4.6mm，粒径5μm）。流动相为甲醇+0.5%高氯酸溶液（体积比30+70），等梯度洗脱，流速1.0mL/min；柱温35℃；进样量20μL；检测波长230nm。取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中甲氧苄啶响应值应在仪器检测的线性范围之内。

5.定量结果计算

试样中甲氧苄啶残留量计算公式：

式中　X——试样中甲氧苄啶的残留量，μg/g；

c——试样溶液中甲氧苄啶的浓度，μg/mL；

V——最终定容体积，mL；

m——供试试料质量，g。

6.应用特点

与其他方法相比，本方法的前处理过程通过pH的转换，分别在酸性和碱性条件下进行提取，大部分杂质在这两步被去除，然后再配合MCX柱净化，进一步去除了阴离子形式存在的杂质，故最终的色谱分离中目标物的干扰会比较少。图1-30中目标物的出峰情况证实了这种前处理过程的有效性。当然，这种多步骤的萃取和净化对目标物带来的损失也是不可忽略的，但考虑到本方法的定量限为20μg/kg，最终的回收率在70%～110%，符合残留分析的要求。

（三）乳制品中牛磺酸的测定（参考GB 5009.169—2016）

1.背景简介

牛磺酸的化学名为2-氨基乙磺酸（2-aminoethansulfonic acid），化学式为C2H7NSO3），是一种含硫β-氨基酸，广布于动物组织之中。研究表明，牛磺酸具有广泛的生理功能，是调节机体正常生理功能的重要活性物质，在实际生产和日常生活中具有广泛的应用价值。一般认为，机体内的牛磺酸一部分与胆酸结合组成牛磺胆酸，起着促进脂类及其相关物质的消化吸收的生理功能。同时，牛磺酸也是神经传递体、抗氧化剂和膜保护剂、钙离子内环境的稳定调节剂，对于促进大脑发育、增强视力、调节神经组织的兴奋性、增加心肌收缩力等具有重要的意义。对于新生儿而言，体内合成牛磺酸的酶系尚未成熟，如果在奶粉中添加接近母乳水平的牛磺酸，就能有效保障婴幼儿的身体发育。因此，目前国内外均将牛磺酸作为重要的食品添加剂使用，尤其规定在婴幼儿食品中必须添加一定量的牛磺酸。但是，若补充过量的牛磺酸，就会抑制体内其他营养元素的吸收。因此，为了有效评价乳制品的品质，从根本上保障婴幼儿食品的安全，有必要对乳制品中牛磺酸的含量进行测定。

2.方法的选择

国内外有关牛磺酸检测方法主要有酸碱滴定法、分光光度法、薄层色谱法、荧光法、液相色谱法、氨基酸分析仪测定法等。酸碱滴定法是我国1993年制定的牛磺酸国标测定方法，此方法简便易行，原理简单，但灵敏度及准确度均较低，且测定过程中干扰较多，样品的差别较大。分光光度法和薄层色谱法的检测灵敏度较低；荧光法对前处理要求比较高；氨基酸分析仪测定法检测成本高，耗时长，不利于完成大批量的检测任务。高效液相色谱法具有样品前处理简单、灵敏度和准确度较高、耗时短等优点，在牛磺酸的实际检测中获得广泛的应用。我国2016版国标中删除了薄层色谱法，将检测方法均改为HPLC法。

GB 5009.169—2016食品中牛磺酸的测定中第一法和第二法为液相色谱法。其中，第一法用水溶解试样，用偏磷酸沉淀蛋白，经超声波振荡提取、离心、微孔膜过滤后，通过钠离子色谱柱分离，并与邻苯二甲醛（OPA）发生衍生反应，用荧光检测器进行检测，外标法定量，定量限为0.5mg/100g。第二法用水溶解试样，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质。取上清液用丹磺酰氯衍生反应，衍生物经C18反相色谱柱分离。用紫外检测器（254nm）或荧光检测器（激发波长330nm；发射波长530nm）检测，外标法定量，荧光检测法的定量限为0.1mg/100g，紫外检测法的定量限为5mg/100g。

3.邻苯二甲醛（OPA）柱后衍生法

（1）提取方法　对于固体试样，称取1～5g（精确至0.01g）于锥形瓶中，加入40℃左右温水40mL，摇匀使试样溶解，放入超声波振荡器中超声提取10min。再加50mL偏磷酸溶液，充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取10～15min，取出冷却至室温后，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀，样液在5000r/min条件下离心10min，取上清液经0.45μm微孔膜过滤，接取中间滤液以备进样。

对于液体试样，称取试样约5～30g（精确至0.01g）于锥形瓶中，加50mL偏磷酸溶液，充分摇匀。放入超声波振荡器中超声提取10～15min，取出冷却至室温后，移入100mL容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀。样液在5000r/min条件下离心10min，取上清液经0.45μm微孔膜过滤，接取中间滤液以备进样。

对于乳饮料试样，称取5～30g试样（精确至0.01g）于锥形瓶中，加入40℃左右温水30mL，充分混匀，置超声波振荡器上超声提取10min，冷却到室温。加1.0mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入1.0mL乙酸锌溶液，涡旋混合，转入100mL容量瓶中用水定容至刻度，充分混匀，样液于5000r/min下离心10min，取上清液经0.45μm微孔膜过滤，接取中间滤液以备进样。

（2）仪器检测方法　采用钠离子氨基酸分析专用色谱柱（25cm×4.6mm），流动相为pH3.2的柠檬酸三钠溶液，流速为0.4mL/min，柱温55℃。荧光衍生溶剂（邻苯二甲醛溶液）的流速为0.3mL/min。荧光检测器的激发波长为338nm，发射波长为425nm。进样量为20μL。将试样溶液和系列标准溶液顺次进样，以色谱峰高或峰面积结合标准曲线计算待测溶液中牛磺酸的浓度（图1-31）。

4.丹磺酰氯柱前衍生法

（1）提取方法

① 对于固体试样，称取1～5g（精确至0.01g）于锥形瓶中，加入40℃左右温水40mL，摇匀使试样溶解，放入超声波振荡器中超声提取10min。冷却到室温，加1.0mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入1.0mL乙酸锌溶液，涡旋混合，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。样液于5000r/min下离心10min，取上清液备用。

② 对于液体试样，称取5～30g（精确至0.01g）于锥形瓶中，加20mL水，充分摇匀。加1.0mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入1.0mL乙酸锌溶液，涡旋混合，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。样液于5000r/min下离心10min，取上清液备用。

③ 对于乳饮料试样，称取5～40g试样（精确至0.01g）于锥形瓶中，加入40℃温水20mL，充分混匀，置超声波振荡器上超声提取10min，冷却到室温。加1.0mL亚铁氰化钾溶液，涡旋混合，再加入1.0mL乙酸锌溶液，涡旋混合，转入100mL容量瓶中，用水定容至刻度，充分混匀。样液于5000r/min下离心10min，取上清液备用。

提取说明：牛磺酸为易溶于水的两性化合物，并且常以游离态存在于样品中，因此水能完全提取奶粉中牛磺酸，而采用加热和超声辅助萃取样品时提取效果更佳。但由于部分乳制品呈乳浊液，为去除溶液中乳状体，所以需要加入沉淀蛋白试剂。

（2）柱前衍生　准确吸取1.00mL提取所得上清液到10mL具塞玻璃试管中，加入1.00mL碳酸钠缓冲液和1.00mL丹磺酰氯溶液，充分混合，于室温避光衍生反应2h（1h后需摇晃1次），然后加入0.10mL盐酸甲胺溶液，涡旋混合以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，待测。

注意：系列标准溶液必须与试样溶液同步进行衍生。

（3）仪器检测方法　采用C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙酸钠缓冲液+乙腈（体积比70+30），流速为1.0mL/min，柱温为室温。荧光检测器的激发波长330nm，发射波长530nm。若使用紫外检测器或二极管阵列检测器，则检测波长254nm。进样量20μL。色谱结果见图1-32、图1-33。

5.定量结果计算

试样中牛磺酸含量按下式计算：

式中　A——试样中牛磺酸的含量，mg/100g；

c——试样测定液中牛磺酸的浓度，μg/mL；

V——试样定容体积，mL；

m——试样质量，g。

6.应用特点

牛磺酸同许多氨基酸一样，其分子式中没有共轭结构，故其紫外吸收和荧光发射都比较弱。当样品中牛磺酸含量较低时，需要对其进行衍生化反应，即在其结构中加入紫外吸光基团，才能满足液相色谱仪检测器（如紫外检测器或荧光检测器）的灵敏度要求。在应用中涉及了衍生的两种方式：柱前衍生和柱后衍生，为不同实验室根据自身条件进行选择提供了便利。并且，两种衍生法的定量限在0.1～5mg/100g之间，均可实现乳制品中牛磺酸含量的准确测定。

（四）食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的检测方法（参考GB 5009.28—2016）

1.背景简介

苯甲酸（C7H6O2）又称安息香酸，是苯环上的一个氢被羧基（-COOH）取代形成的化合物。由于苯甲酸有抑制真菌、细菌、霉菌生长的作用，苯甲酸及其钠盐作为食品添加剂在乳胶、牙膏、果酱或其他食品中有广泛的应用。苯甲酸及其钠盐本身具有一定的刺激性，但在人体和动物组织中可与蛋白质成分的甘氨酸结合形成马尿酸，从而不会危害人体。然而，若过量摄入，不仅能破坏维生素B1，还能使钙形成不溶性物质，影响人体对钙的吸收，同时对胃肠道有刺激作用，可诱发癌症、哮喘、荨麻疹及血管性水肿等变态反应。近年来的研究还表明，当苯甲酸（钠）与维生素C混合后，会生成化合物苯，而苯可以影响细胞的线粒体，并且造成细胞死亡。因此，目前国内外都对食品中苯甲酸及其钠盐的使用有严格的限定。

山梨酸是一种不饱和脂肪酸，能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性，能防止肉毒杆菌、葡萄球菌、沙门菌等有害微生物的生长和繁殖，在食品工业中是一种重要的防腐剂。从安全性方面来讲，山梨酸在人体内参与新陈代谢过程，并被人体消化和吸收，产生二氧化碳和水，较为安全。但是如果食品中添加的山梨酸超标严重，消费者长期服用，在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康。

糖精钠是邻苯甲酰磺酰亚胺（糖精）的钠盐，其甜度比蔗糖甜300～500倍，是食品工业中常用的合成甜味剂。但糖精钠是一种食品添加剂，除了在味觉上可以引起甜的感觉外，对人体无任何营养价值，而且一旦食用较多糖精钠，会影响肠胃消化酶的正常分泌，降低小肠的吸收能力，若短时间内食用大量糖精，还会引起血小板减少而造成急性大出血、多脏器损害等。自2005年以来，糖精在食品中的应用有明显的超范围、超量现象，一些厂商为了降低成本赚取暴利，在饮料、果脯甚至专供儿童消费的果冻等食品中，普遍使用对人体有害无益的糖精来代替蔗糖，但在食品标签上却不作任何明示，或冠以“蛋白糖”“甜宝”等美名掩盖使用糖精的事实，损害了消费者的身体健康，严重侵犯了消费者的知情权，已引起了社会各界和广大消费者的密切关注。

综上所述，苯甲酸、山梨酸和糖精钠都是目前食品工业中应用较为广泛的食品添加剂，但在过量使用的情况下，都会对人体产生危害，因此对食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠进行检测是食品安全领域的一个重点。

2.方法的选择

苯甲酸、山梨酸都属于防腐剂，两者的检测方法较为接近，主要有薄层色谱、分光光度法、气相色谱法和HPLC等。而糖精钠属于甜味剂，可以用薄层色谱法、硫代二苯胺比色法、分光光度法和HPLC等。本应用中要将三种物质同时进行检测，由于糖精钠无法用气相色谱法检测，故不宜采用；薄层色谱法和分光光度法灵敏度较差，定型能力弱，不适用，因此HPLC法在本应用情况中最为合适，并且操作简单，定量准确。HPLC目前也是我国食品添加剂检测标准中的常用方法。

GB 5009.28—2016规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定的方法，方法的定量限均为0.01g/kg。方法以水对样品中的目标物进行提取，对高脂肪样品经正己烷脱脂，高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。

3.提取方法

对于一般性试样，称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min，冷却至室温后加亚铁氰化钾溶液2mL和乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min离心5min，将水相转移至50mL容量瓶中，于残渣中加水20mL，涡旋混匀后超声5min，于8000r/min离心5min，将水相转移到同一50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22μm滤膜，待液相色谱测定。

对于含胶基的果冻、糖果等试样，称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加水约25mL，涡旋混匀，于70℃水浴加热溶解试样，50℃水浴超声20min，然后按照如上操作进行。

对于油脂、巧克力、奶油、油炸食品等高油脂试样，称取约2g（精确到0.001g）试样于50mL具塞离心管中，加正己烷10mL，于60℃水浴加热约5min，并不时轻摇以溶解脂肪，然后加氨水溶液（1+99）25mL、乙醇1mL，涡旋混匀，于50℃水浴超声20min，冷却至室温后，加亚铁氰化钾溶液2mL和乙酸锌溶液2mL，混匀，于8000r/min离心5min，弃去有机相，水相转移至50mL容量瓶中，残渣再提取一次后测定。

4.仪器检测方法

采用C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。流动相为甲醇+乙酸铵溶液（5+95），流速1mL/min，进样量10μL，检测波长230nm。当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，如以甲醇+甲酸-乙酸铵溶液（8+92）作流动相。液相色谱图见图1-34、图1-35。

图1-34　1mg/mL苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准溶液的液相色谱图
（流动相：甲醇+乙酸铵=5+95）

图1-35　1mg/mL苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准溶液的液相色谱图
（流动相：甲醇+甲酸-乙酸铵溶液=8+92）

采用上述色谱条件分别对标准系列溶液、试样溶液和空白试验溶液进样检测。

5.定量结果计算

依据得到的试样溶液的峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸和糖精钠（以糖精计）的质量浓度，按照如下公式计算最终样品中目标物的含量：

式中　X——试样中待测组分含量，g/kg；

ρ——由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，mg/L；

V——试样定容体积，mL；

m——试样质量，g；

1000——换算因子。

6.应用特点

添加剂使用不规范、超量、超范围使用是影响食品安全的重大隐患。但由于食品添加剂种类繁多，数量庞大，实现快速、高通量的多残留检测是检测技术发展的趋势。苯甲酸、山梨酸和糖精钠三种常见的食品添加剂用统一方法进行检测是本应用的特点，其有效地利用HPLC法高效的物质分离能力，对两种类别的食品添加剂同时进行检测，整个方法简单易行，灵敏度高，稳定性好，推广使用的潜力大。

（五）食品中黄曲霉毒素的测定（参考GB 5009.22—2016）

1.背景简介

黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉和特曲霉等产生的有毒代谢产物，当粮食未能及时晒干及贮藏不当时，往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素。黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2以及黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2，其中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2是黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2在奶牛体内代谢产生的。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，而花生和玉米则是最容易被黄曲霉污染的粮食。1960年英国曾发生10万只火鸡因食用产生了黄曲霉毒素的花生粕饲料而死亡的事件。1993年世界卫生组织的癌症研究机构将黄曲霉毒素划定为一类致癌物，其危害性在于对人及动物肝脏组织有极强的破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中黄曲霉毒素B1通常被认为具有最强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要污染粮油食品、动植物食品等，如花生、玉米、大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染的风险，因此，对食品中黄曲霉毒素进行测定是食品安全的一个重要课题。

2.方法的选择

黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、质谱法、放射免疫测定法。这些方法中，“免疫亲和柱净化”是众多方法均采用的一个步骤，而由此衍生的快速筛选法（酶联免疫吸附测定法等）也是现在国际公认的比较经济有效的初筛方法。但从方法定性、定量和实际应用的要求考虑，免疫学方法在定性上略有不足，质谱法的仪器相对昂贵，无法在基层大量推广。因此，就有效应用而言，液相色谱法无疑是目前国内外测定黄曲霉毒素的重要手段。

我国的食品安全国家标准GB 5009.22—2016中的第二法和第三法均为液相色谱法，其中第二法为高效液相色谱-柱前衍生法，第三法为高效液相色谱-柱后衍生法，两者的适用范围包括谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品。上述方法通过乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2，提取液经黄曲霉毒素固相净化柱或免疫亲和柱净化，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质，用三氟乙酸柱前衍生，液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量；或者经液相色谱分离，柱后衍生（碘或溴试剂衍生、光化学衍生、电化学衍生等），经荧光检测器检测，外标法定量。

3.提取方法

对于植物油脂类液体样品，称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min，取上清液备用。

对于酱油和醋，称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，用乙腈或甲醇定容至25mL（精确至0.1mL），涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

对于一般固体样品，称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

对于婴幼儿配方食品及辅助食品，称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（50+50）或甲醇-水溶液（70+30），涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

对于半流体样品，称取5g试样（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min（或用均质器均质3min），在6000r/min下离心10min（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

若采用专用固相萃取柱净化-柱前衍生法，则移取适量上述提取过程的上清液，按黄曲霉毒素专用固相萃取净化柱的要求进行净化，收集全部净化液。用移液管准确吸取4.0mL净化液于10mL离心管后在50℃下用氮气缓缓地吹至近干，分别加入200μL正己烷和100μL三氟乙酸，涡旋30s，在40℃±1℃的恒温箱中衍生15min，衍生结束后，在50℃下用氮气缓缓地将衍生液吹至近干，用初始流动相定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，过0.22μm滤膜，收集滤液于进样瓶中，以备进样。

若采用免疫亲和柱净化-柱后衍生法，则将上述样液移至50mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1～3mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入2×10mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置10mL刻度试管，取下50mL的注射器筒，2×1mL甲醇洗脱亲和柱，控制1～3mL/min的速度下滴，再用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用初始流动相定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

注意事项：免疫亲和柱需要按要求进行保存，在质量品质上要求AFTB1的柱容量≥200ng，AFTB1的柱回收率≥80%，AFTG2的交叉反应率≥80%。尤其需要关注不同批次间免疫亲和柱的质量差异，务必通过验证方法进行验证。

4.液相色谱检测方法

采用柱前衍生法时，以水（A）和乙腈-甲醇溶液（B，50+50）作为流动相，用梯度洗脱程序进行目标物洗脱：24%B（0～6min），35%B（8.0～10.0min），100%B（10.2～11.2min），24%B（11.5～13.0min）；用C18柱（柱长150mm或250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5.0μm）或相当者作为色谱分析柱；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样体积50μL；检测波长为激发波长360nm，发射波长440nm（图1-36、图1-37）。

采用柱后衍生法时，可以应用多种方法对目标物进行衍生，以电化学柱后衍生为例，液相色谱参考条件如下：

① 流动相：A相为水（1L水中含119mg溴化钾，350μL 4mol/L硝酸）；B相为甲醇。

② 等梯度洗脱条件：A，60%；B，40%。

③ 色谱柱：C18柱（柱长150mm或250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm），或相当者。

④ 柱温40℃。

⑤ 流速1.0mL/min。

⑥ 进样量50μL。

⑦ 电化学柱后衍生器：反应池工作电流100μA；1根PEEK反应管路（长50cm，内径0.5mm）。

⑧ 激发波长360nm；发射波长440nm。

5.定量结果计算

依据标准系列溶液所得的标准曲线对试样溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的含量进行计算，按照如下公式计算最终样品中目标物的含量：

式中　X——试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量，μg/kg；

ρ——进样溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2按照外标法在标准曲线中对应的浓度，ng/mL；

V1——试样提取液体积（植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积；酱油、醋按定容总体积），mL；

V3——样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，mL；

V2——用于免疫亲和柱的分取样品体积，mL；

m——试样的称样量，g。

6.应用特点

用液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素快速、准确，在实际领域应用较广。相比于质谱法的定量精准和定性准确，液相色谱法提供了定性基本准确，但更加宽泛的选择性，如多达5种的不同衍生方式为基质具体操作人员提供了极大的便利。