第三节　检测流程

流式细胞术的基本检测流程包括9个步骤，包括标本准备、标本处理、开机、仪器光路与流路检查与校准、上机测定（即上样测定）、结果分析和检验报告、仪器清洗和关机。

一、标本准备

标本准备包括采集、运送与保存的全程，是流式检测的第一步，也是检测成功与否的关键所在。详细内容见第四章。

二、标本预处理

标本处理指为达到检验目的而对标本施行的一系列处置，包括对标本最佳检验成分的分离（如单细胞悬液的制备）、荧光染色反应及其后续的对反应体系进行的溶血、固定处置等。如T淋巴细胞亚群分析：首先，加样使血液样品与CD3-PC5、CD4-FITC和CD8-PE抗体混合，通过抗原抗体结合反应，对淋巴细胞进行荧光染色。其次，需要对反应体系进行溶血处理，以破坏其中的红细胞，减轻红细胞对测定的影响。最后，再对溶血的反应体系进行平衡和固定。如血小板相关流式检验项目，一般需要事先分离含血小板的血浆，然后再以此血浆为分析样品，与荧光染料标记的血小板相关检验内容的抗体进行抗原抗体结合反应，最后对反应体系进行固定。如细胞因子流式定量分析，需要分离血浆或血清，然后以血浆或血清为分析样品，与标记有待测细胞因子抗体的一定大小的荧光微球混合，进行抗原抗体结合反应，使微球捕获血浆或血清中的靶细胞因子。如实体瘤组织细胞周期分析，需要制备实体瘤组织的单细胞悬液（详见第三章），然后才能用PI染色液对单个细胞的DNA进行染色。

标本处理过程短则需要40～50分钟，长则需要1～2小时（如需要从实体瘤组织中制备单细胞悬液）。因此，上班后宜先对标本进行处理，待加样完成进入抗原抗体反应阶段的孵育后再开机。

三、开机程序

不同品牌的流式细胞仪，其开机程序基本一致，具体方法详见第二篇各相应章节。开机前后需要注意的问题如下。

1.开机前，一定要检查鞘液盒、清洁液盒内液体水平，以及废液桶是否废液已满需要倒掉。

2.开机后，一定要检查真空管及系统压力。

3.仪器需要预热大约需要30分钟，待激光稳定才能进入下一工作程序。

四、仪器光路与流路的检查与校准

不同品牌的流式细胞仪，其光路与流路检查校准程序基本一致，具体方法详见第二篇各相应章节。值得注意的是，当出现FS、FL中有HPCV大于2%的情况，处理方法如下。

1.再次确定仪器是否预热30分钟，如果预热时间不够需要继续预热，再进行Flow-Check上样测定。

2.可能流路存在阻塞或有气泡，按主机上的PRIME键，待仪器自动排除气泡后再重新用Flow-Check检查一次。有的时候需要连续多次进行PRIME除泡才能通过。

3.流式细胞仪器的流速是否处于低档（LOW），流速太快检测效果欠佳。

4.仪器管道系统中可能有蛋白质黏附等不畅的情况，需要执行清洗程序，对管道系统进行必要的清洗。

5.如果以上处理均达不到要求，则需要对仪器的光路进行校准。光路校准最好由工程师进行。

五、测定程序

仪器准备就绪，样品处理完成，即可进行上机测定。不同品牌的流式细胞仪，其上样测定程序略有不同，具体方法详见第二篇各相应章节。

六、结果分析与报告

流式检验的结果分析包括两种情况：一种是指某些流式检验项目，先上机测定，完成之后需要打开另外的专用软件，对原始采集结果进行分析加工，才能获得需要的检验信息，如流式细胞周期分析；另一种是指对检验结果存在疑问需要复查时，可以直接调出原始检验结果，重新对结果进行分析，即复查。

（一）细胞周期分析

在Beckman-Coulter XL-MCL流式仪，简便快捷的细胞周期分析方法是采用Multicyle for Windows 32-bit软件，以自动分析方式对DNA测定时采集的信号进行快速细胞周期分析，具体方法如下。

1.打开分析窗口

双击Windows桌面Multicyle for Windows 32-bit图标→File→Open→在C：XL/lmd中找到并点击DNA检验时得到流水号，如Z0001730 →打开。

2.打开待分析原始采集图像

在Z0001730.LMD窗口的右侧，在AUX（FL3 PEAK）对应的Mcycle竖列处小方格内点击画上勾（√）→在Z0001730.LMD窗口下端点击OK→在弹出的Analyze One Cell Cycle窗口中点击OK→软件自动对Z0001730采集的DNA信息进行分析，得到细胞周期分析图像及相应数据的计量结果。

3.打印或记录分析结果

打印结果的方法是File→Print→确定。如果电脑安装了PDF软件，还可以通过打印功能将DNA分析的图像及计量结果转换成PDF文件以方便保存。也可以以复制、粘贴的方式，将图形结果拷贝到Office自带的绘画工具或PhotoShop中。

（二）流式检验结果复查与分析

1.DOS系统检验结果的复查与分析

（1）打开待分析原始采集结果：在ACQUISITION界面下，点击Application，选择Listmode→在File下拉菜单中，点击SELECT，选择所要分析的文件，点击OK →点击屏幕下方的PLAY NEXT按钮，显示检验结果的原始图像。

（2）检验结果的复查：逐一查对检验结果。

（3）检验结果的分析：当有质疑需要重新对原始图像进行分析，以得到合理的检验结果时，点击屏幕右下蓝色的REGION使之成为红色，即可重新对原始图像进行编辑，如调整门的大小与位置、增设门等，对检验结果进行必要的修正。

（4）结果保存与打印。

2.Windows系统检验结果的复查与分析

（1）打开分析窗口：双击Windows桌面EXPO32 ADC Analysis图标→选择用户名并输入用户密码→下一步→完成。

（2）打开分析方案：在左侧竖窗内，选择用户名→选择待打开原始采集结果所使用的采集方案名，如CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE→压住鼠标左键将方案拖入中央窗口的空白处，松左键即弹出方案。

（3）打开待分析原始采集结果：File→Open Listmode File→LMD→选择需要打开的采集结果的流水号，如Z0005173→OK。

（4）检验结果的复查：逐一查对检验结果。

（5）检验结果的分析：当有质疑需要重新对原始图像进行分析时，可直接对原始图像进行编辑，如调整门的大小与位置、增设门等，对检验结果进行必要的修正。

（6）结果保存与打印。

七、检验报告

完成上机测定并得到检验图像和数据结果后，即可向临床做出流式检验报告。

目前流式检验报告尚无统一的格式和标准，可以是计量资料报告、图像报告，也可以是两者的结合，即图文报告。无论是哪种报告方式，都需要将临床有用的流式检验信息尽量提供给临床，以满足临床疾病诊疗的需要。

另外，流式细胞学检验技术虽然已经是一门成熟的单细胞学分析技术，但是将其用于临床检验领域仍然历史较短，并且至今尚未普及，因此，还缺乏全国范围或一定地区内人群的正常参考范围值。国外公司提供的数据或文献报道的小量样本测定结果可以适当参考，但仍然需要制订本室的流式检验参考范围，毕竟同样的检验目的，不同的检验科制定的流式检验方案不统一、标本处理程序与具体方法不统一、试剂来源、仪器性能等不统一，这些都容易影响检验结果的横向可比性。

八、仪器清洗

不同品牌的流式细胞仪，其清洗程序大致相同，仅略有差别，具体方法详见第二篇各相应章节。

九、关机程序

不同品牌的流式细胞仪，其关机程序基本一致，具体方法详见第二篇各相应章节。