炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。目前认为，IBD的发生是由于多种因素作用于遗传易感宿主，这些因素主要包括遗传、环境、免疫和肠道菌群 ^［1］。大量研究表明，肠道菌群是触发炎症性肠病发生和发展的重要因素 ^［1，2］。本章节主要介绍肠道菌群的功能，炎症性肠病与微生物组（microbiome）的关系，肠道微生物组的实验模型及其在IBD治疗中的临床应用。

既往医学教科书中，鲜有涉及肠道菌群或微生物组这一概念。目前研究认为，肠道菌群是一种被我们忽略的器官 ^［3］。近年来，微生物组学领域研究上取得的巨大进展使我们认识到肠道菌群在疾病发病机制中发挥着重要作用。2005年，Robin Warren和Barry Marshall两人因在幽门螺杆菌与胃炎、胃溃疡相关性方面做出的突出贡献，获得诺贝尔医学奖。提示我们，人类某些疾病的解决之道并不仅仅取决于宿主本身，还应诉诸与之密切接触的外环境中的微生物。宿主肠黏膜上皮细胞将其与肠腔环境中的多种微生物群落隔离，并不断适应彼此之间的双向物质交换 ^［3］。因此，肠道菌群的代谢活动相当于一个实体器官中的虚拟器官 ^［4］。

肠道细菌（共生菌）的数量远超过与之接触的肠黏膜上皮细胞数目，其数量超过人体细胞的10倍 ^［5］。基于此，我们可以认为每个个体都是由90%的微生物和10%的人类细胞组成。个体肠道中包含约500～1000种细菌，其基因数目百倍于人体。微小的肠道细菌总重量大约有3磅重（约1.36077711kg）。

肠道中活体细菌的数量达10 ¹¹～10 ¹²个/克粪便，与实验室最佳环境下培养平皿的克隆计数一致 ^［6］。在胃和十二指肠中，细菌数目为10 ¹～10 ³CUF/ml，空肠为10 ⁴～10 ⁷CUF/ml，结肠含量最高，可达到10 ¹²～10 ¹³CUF/ml。过去认为食管表面无细菌定植。然而，最近研究发现食管疾病也与微生物组相关。在食管远端，黏膜炎症和肠上皮化生的发生与食管微生物组改变相关。这些研究结果提示菌群失调可能在反流性疾病发病机制中发挥作用 ^［7］。同样，既往研究认为肠道细菌主要位于肠腔内，但最新研究显示黏膜隐窝中也有细菌存在 ^［8］。

研究显示，远端结肠和近端结肠内环境亦存在一定差异。与远端结肠相比，近端结肠pH较高，细菌发酵活动旺盛。另一个影响肠道细菌代谢活动和相互竞争的关键因素是碳水化合物能源和氮源的相对可利用性。与近端结肠相比，到达远端结肠的可发酵碳水化合物相对较少，导致沿结肠方向内源性蛋白和可消化的碳水化合物在数量上出现差异 ^［6］。高蛋白饮食可增加到达大肠的膳食蛋白含量。pH和多肽的供应能从根本上改变人体结肠微生物菌落中细菌的数量和短链脂肪酸的比例 ^［9］。此外，许多结肠黏膜基因出现的差异性表达均受到微生物信号的调控，肠道菌群的组成也存在区域性差异。

新生儿在出生时及其后数天内肠道开始出现细菌定植。分娩方式、饮食以及所接触的环境均可改变新生儿肠道菌群结构 ^［10］。新生儿肠道细菌的初始定植情况能显著影响其成年后肠道恒定菌群组成。尽管研究显示，生活方式、饮食以及年龄影响成人肠道菌群组成，但是采用不同的遗传关联程度对比研究成人肠道菌群组成发现，宿主表型通过环境因素对个体胃肠道菌群多样性具有普遍影响 ^［11］。

宿主与其肠道菌群之间不断相互适应，这一选择过程使肠道菌群结构和组成相对稳定，并保持肠道菌群功能稳定，彼此互利互惠 ^［3］。如表8-1所示，肠道微生态的主要功能包括发挥保护作用、加强屏障功能、促进黏膜免疫系统发育以及促进代谢的功能 ^［3］。因此，为达到互利互惠的目的，人体需要摄入足够的蔬菜和水果以提供给细菌足够的食物并维持其结构和功能的健全。

在2008年，美国NIH启动了人类微生物组项目（human microbiome project，HMP）以描述和定义肠道微生物的特征。HMP通过测序细菌16S rRNA基因、细菌和真核细胞mRNA表达，初步确立了人体不同部位细菌种类、相关基因及其转录本的丰度 ^［12-14］。样本采集可在家庭内收集，或不同文化背景及生活方式的人群。比较宏基因组学进一步阐明肠道多种功能由肠道细菌完成：①从食物中收集难以经人体消化酶消化的成分并合成相关营养成分，如维生素；②净化外源性有毒物质并影响代谢类型；③为上皮细胞更新提供信号，维持肠黏膜上皮完整性；④促进黏膜免疫系统健全发育；⑤影响个体的生理状态，如心脏的大小、行为方式等等 ^［15］。

尽管大量研究提示肠道菌群是驱动IBD炎性过程的基本因素，但是目前仍然没有发现单一细菌可触发该病理过程。IBD患者肠道菌群组成与健康人群不同，将肠道菌群结构和数量的失衡称为肠道菌群失调（dysbiosis）。当遗传易感宿主的肠道菌群失调就可能导致IBD的发生。宿主和环境因素并非相互排斥，而是相互作用最终触发或促进肠道慢性疾病。

IBD患者黏膜拟杆菌科（Bacteroidaceae）组成与健康人群不同 ^［16］。研究显示，在CD患者肠黏膜中，T淋巴细胞对细菌来源的抗原反应过度，且黏膜局部针对细菌抗原的免疫耐受缺失 ^［17］。此外，IBD患者肠黏膜中针对肠道共生菌的IgG型抗体升高 ^［18］。与IgA引起的正常的黏膜免疫反应不同，IgG型免疫反应能激活补体和炎性级联反应介质，导致黏膜损伤。而且，与健康人群相比，IBD患者肠黏膜上皮细胞表面黏附的细菌较多 ^［19］，种类多样；其中，部分细菌可黏附在上皮细胞层，一部分则可进入上皮细胞内 ^［19］。

肠道菌群可控制易感宿主IBD肠炎的进展。肠道菌群尤其是共生菌和宿主防御能力在黏膜界面的动态平衡在IBD的发生和发展中发挥重要作用。研究证实抗生素治疗对部分IBD患者有效；近年研究发现所谓的“健康细菌”或益生菌的应用能缓解IBD患者症状，均支持肠道菌群在IBD的发生和发展中发挥重要作用。此外，在IBD患者中，肠道菌群如大肠埃希菌（大肠杆菌）黏附到肠黏膜上皮细胞的情况更常见，并有一定数量的细菌侵入到黏膜上皮细胞中。多种品系的免疫缺陷动物模型证实其自发性肠炎的出现与否似乎完全取决于肠腔细菌的出现，进一步证实肠道菌群在IBD的发病中发挥重要作用。这些品系的免疫缺陷小鼠在无菌环境下饲养并不发生肠炎，但在细菌出现时，即使是肠道共生菌，也会导致肠炎发生 ^［20］。

另一项关于IBD与肠道菌群关系的理论认为，IBD的发生部分上归因于黏膜免疫系统对肠道共生菌的异常免疫应答，包括对具有益生作用的共生厌氧菌多形拟杆菌（ Bacteroidesthetaiotaomicron， B. theta）的应答。用肠道共生菌群定植无菌的HLA-B27转基因小鼠和同品系正常小鼠后，发现HLA-B27小鼠出现慢性肠炎，同品系正常小鼠并未观察到肠炎 ^［21］。最近有研究认为， B. theta可诱导HLA-B27 Tg小鼠发生肠炎，可能与细菌基因对影响宿主免疫反应的代谢和营养结合相关通路调节有关。这些关于肠道菌群和遗传易感宿主相互作用的研究证实肠道菌群在IBD发病过程中的作用，并为IBD的治疗提供新靶点 ^［21］。

肠道菌群能调节宿主多种生理功能，并且是IBD发病的关键因素之一。但是，到目前为止，我们对肠道菌群本身的多样性和复杂性认识并不充分，这就限制了我们对宿主-微生物相互作用的深入了解。进一步深入地对IBD患者肠道菌群组成特征、动态变化（dynamics）和功能的研究有助于理解IBD的发病机制，并为IBD治疗提供有效的策略。

研究肠道菌群的传统方法包括显微镜检和培养法；但是，大多数细菌不能检测和培养出来。现代微生物分子生态学方法，如通过提取并扩增粪便和黏膜中细菌核酸的16S rRNA并进行测序克服了这一问题。因为16S rRNA基因存在于所有微生物中，而且结构和功能相对保守，序列变化缓慢，在原核生物中不发生水平转移，成为微生物分子生态学最常用的特征序列。Eckburg等人采用基于细菌16S rRNA测序的研究方法第一次报道了人肠道微生物的多样性 ^［22］，提示利用细菌的16S rRNA进化性趋异（evolutionary divergence）可以对细菌进行鉴定并分类。细菌测序数据的实用性大大促进了荧光原位杂交、DNA微阵列、基因芯片分子探针技术的发展，利用这些技术可鉴定特定细菌并进行定量 ^［3］。这些分子生物学方法已经用于检测个体肠道菌群随时间出现的特征和稳定性改变，以及断奶、抗生素使用及饮食改变后肠道菌群组成的改变。

无菌生物模型（无菌动物）为我们深入理解肠道菌群的功能提供了巨大的帮助。在无菌实验室中，小鼠用单独的无菌隔离器隔离，空气以及小鼠所需要的食物和水均为无菌状态。

无菌动物模型的使用，使我们认识到个体生命与细菌共存。与普通环境饲养的小鼠相比，无菌小鼠除肠黏膜嗜铬细胞增加外，其肠黏膜血管数量、分泌的消化酶活性、肌纤维厚度、细胞因子产量、血清免疫球蛋白水平、Peyer结节直径和肠黏膜上皮淋巴细胞数量均出现不同程度的下降，且更容易罹患感染性疾病 ^［2］。然而，无菌小鼠再补充肠道菌群后，肠黏膜免疫系统可进一步发育到与普通小鼠相似的水平 ^［23］。但是，在某些情况下，用单一的正常细菌定植免疫缺陷小鼠可导致肠炎发生，如 Bacteroidesvulgatus可引起IL-10免疫缺陷小鼠发生肠炎发生 ^［24］。这些研究充分说明，宿主防御能力决定其与肠道菌群相互作用的结局，而不是肠腔中的细菌本身引发这种相互作用的结局。

大量研究使用特定的细菌定植于无菌动物（如无菌斑马鱼、小鼠、大鼠和猪）。这些研究使我们对肠道特定细菌的功能有了深入的了解，并为遗传易感宿主易罹患IBD提供了初步的合理解释。譬如，目前研究认为，在过去几个世纪，西方人群肠道菌群可能已经发生改变，这种新发的环境因素往往对人体产生不利的影响。最近，有研究采用无菌动物模型研究饮食对肠道菌群组成的影响，发现富含饱和脂肪的饮食可改变肠道微生物聚集条件（microbial assemblage），并促进丰度相对较低的亚硫酸盐还原菌沃氏嗜胆菌（ Bilophila wadsworthia）增殖 ^［25］。这一过程伴随TH1免疫反应，使IL-10缺陷的遗传易感小鼠肠炎发病率增加。该研究进一步证实，牛奶来源的脂肪促进肝脏胆汁酸与牛磺酸与结合，促使亚硫酸盐还原菌对有机硫的利用率增加，导致 B. wadsworthia菌增殖。以含牛磺酸的低脂饮食饲养IL-10缺陷的小鼠发现，小鼠肠腔中 B. wadsworthia大量增殖并出现肠炎，而以含甘氨胆酸的低脂饮食饲养的小鼠并未出现该种情况。这些研究表明，饮食中的脂肪通过改变宿主胆汁酸组成，进一步改变肠道菌群的聚集环境，导致肠道菌群失调并触发肠黏膜免疫稳态失衡 ^［25］。

Toll样受体和核苷酸结合寡聚化结合域/半胱天冬酶招募区域亚型受体家族是两种主要的模式识别受体（PRR），调节宿主的天然免疫系统反应。在肠道，PRRs在宿主和肠道菌群互动的信号传递中发挥重要作用。肠上皮细胞和树突状细胞表面均表达TLRs和NOD蛋白 ^［26］。这些PRRs在应答微生物相关分子模式（microbial-associated molecular patterns，MAMP）中发挥重要作用。譬如，肽聚糖和脂磷壁酸（lipotechoic acid）可激活TLR2受体，脂多糖可激活TLR4，TLR5可对入侵的细菌鞭毛蛋白产生应答；NOD1/CARD4和NOD2/ CARD15作为胞内受体应答进入细胞内的肽聚糖亚基。

如同致病菌一样，肠道共生菌以保守模式释放化学信号并被TLRs识别。据此，有研究认为健康个体肠黏膜上皮可消除肠腔内共生菌产生的威胁，从而使定居的共生菌不引起异常的免疫反应 ^［27］。肠黏膜上皮细胞及定居的免疫细胞似乎并非简单的耐受肠道共生菌，而且其结构和功能的成熟也依赖于肠道共生菌。最近研究表明IBD易感基因NOD2和肠道菌群失调发生相关 ^{［28，29］}。小鼠NOD2基因敲除可促进Bacteroidaceae增殖 ^［28］。这些证据表明宿主-肠道菌群的相互作用在健康和疾病中发挥重要作用。

核因子κB是转录因子家族中的成员之一，在天然免疫和获得性免疫反应中发挥重要作用。NF-κB在胞核内具有活性，κBα （IκB）抑制因子可以抑制NF-κB的活性。NF-κB是促炎基因表达的重要的调节分子之一。NF-κB能调节细胞因子的合成，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8以及环氧化酶2（Cox-2）的表达 ^［30］。目前研究已发现，NF-κB在IBD患者中呈现出高度活化的状态。研究亦发现，TLR和NOD信号通路也能调节NF-κB的活性。因此，靶向抑制NF-κB的活性或许对IBD治疗有效。譬如，用于治疗IBD的激素，其部分效应的发挥可能是通过抑制NF-κB的活性。小分子药物包括柳氮磺吡啶及其水杨酸部分5-氨基水杨酸、阿司匹林、其他非激素类抗炎药物及来氟米特也有此作用。柳氮磺吡啶和来氟米特通过抑制IκBα降解阻止NF-κB核易位。这些抗炎作用的发挥可能与NF-κB IKK亚基或其上游信号通路的抑制有关。阿司匹林可能通过竞争NF-κB的活性亚基IKK-β发挥抗炎作用。抑制IL-1和TNF-α分泌的药物，也能抑制NF-κB活性和级联炎性反应。益生菌也可通过抑制NF-κB活性促进肠炎改善 ^［31］。

研究表明维生素D和维生素D受体的表达与人IBD及实验性肠炎负相关。维生素D作为环境因素其缺乏可能促进IBD的发生。在高纬度地区，冬季紫外线减弱会减少皮肤维生素D合成；饮食中维生素D缺乏会导致广泛性维生素D缺乏及维生素D ₃循环水平的季节性变化。流行病学研究发现，IBD患病率在北欧及北美大部分地区较高 ^［32］。研究还发现，IBD患者血清维生素D3水平较健康人低 ^［33］。小儿IBD患者维生素D3缺乏的比例较健康人群高 ^［34］。此外，VDR的mRNA和蛋白表达水平在IBD患者中显著下降 ^［35］。在动物模型中发现，肠道VDR的表达对肠炎的控制是不可或缺的。VDR敲除小鼠对DSS诱导的肠炎更易感 ^{［36. 37］}。同时，VDR受体的下调可促进黏膜炎症加重，促使炎症范围扩大并持续。

VDR信号通路的靶基因包括Cyp24酶和抗菌肽（AMP） ^［38］。VD和VDR在维持肠道稳态中发挥一定作用，能够预防细菌的入侵和感染。但病原菌入侵宿主并被免疫系统识别后，TGF-β和IFN-γ细胞因子被释放；随后，VDR受体被激活并表达更多的抗菌肽（cathelicidin）和防御素，而后两者又能够调节肠黏膜表面细菌的组成。此外，研究发现VDR的表达和TLRs受体具有一定关系，能促进TLR表达并识别细菌 ^［39］。

在IBD实验性肠炎模型中，肠黏膜上皮VDR和肠道细菌密切相关。在VDR敲除的小鼠肠道中，肠道菌群组成发生显著的改变，伴随拟杆菌科（Bacteroidaceae）细菌显著增加。同样，IBD患者肠黏膜表面定植的拟杆菌科细菌也发生改变。这些研究使我们认识到肠黏膜上皮细胞VDR受体的表达可影响肠道微生物组组成。在细胞系、沙门菌相关肠炎、共生菌 E.coli F18单向定植无菌小鼠模型中，证实肠道细菌能够激活VDR信号通路 ^［40］；另外，VDR受体表达能预防侵袭性病原菌的入侵并维持肠道稳态 ^［40］。研究还发现，VDR敲除的小鼠肠道细菌载荷量增加 ^［37］。在体内，VDR信号通路能对肠道病原菌和共生菌产生应答。维生素D及受体水平的下降、肠道菌群数量和多样性的改变，或两者同时改变均可能促进肠炎发生，使肠黏膜屏障破坏，导致食物及其他过敏原致敏及异常免疫耐受总之，1，25（OH） ₂-D ₃的合成和VDR的状态影响肠炎的发展。VDR基因多态性和VDR的表达与IBD的疾病状态相关。VD/VDR信号通路失调参与IBD的发病。VDR表达受损影响肠道细菌的聚集，促进肠道菌群失调，使之与IBD失调的肠道菌群类似。因此，恢复VD/VDR信号通路可能增加IBD患者抵抗黏膜炎症的能力 ^［41］。

有趣的是，VDR、NF-κB以及TLR/NOD2密切联系并参与IBD的发病 ^{［42，43］}。肠黏膜VDR表达负性调节NF-κB的活性。VD3诱导NOD2/CAR- D15-防御素通路激活 ^［44］。这些研究提示，关键信号通路的活化或下调会扰乱肠黏膜稳态，并促进遗传易感宿主发病。

大多数IBD患者在门诊就可进行治疗，而IBD住院病人往往是伴有并发症的患者，甚至需要手术治疗。IBD死亡率相对较低，甚至GERD的死亡率都较IBD高。抗生素和免疫治疗已广泛用于IBD的控制。除了传统的治疗方法，恢复IBD患者肠道菌群组成逐渐成为一种现实可行的治疗方法，并成为预防IBD复发的策略。恢复肠道菌群组成的方法多样；其中，效果最显著的就属粪便移植（fecalmicrobiota transplantation，FMT）、益生菌及饮食调节 ^［45］。

粪便移植这一治疗方式是基于这样一种观念，即肠道庞大的共生微生物组作为最原始的屏障，通过合成并分泌一些抑制性复合物，能有效地预防肠道病原菌通过竞争定植部位和营养成分来入侵胃肠道黏膜，我们将这种肠道菌群能阻抑外来微生物定植的能力成为定植抵抗（colonization resistance） ^［46］。目前，FMT已成功用于艰难梭菌感染（ Clostridium difficile infection，CDI）的治疗。在西方国家随着抗生素耐药的发生，自1996年到2003年，CDI发病率已翻倍并在随后的几年稳步增长 ^［47-49］。随着 C. difficile毒力更强的突变株BI/NAP1/027的出现，CDI的治疗变得更加困难 ^［50］； C. difficile感染患者复发率高达25%，更有甚者，若治疗不连续可诱发多重感染 ^［51］。CDI主要起因于抗生素使用导致的肠道菌群组成紊乱，标准治疗方法逐渐失去疗效，尤其是针对较高的复发率；但是，粪便移植能够治疗难治性CDI并恢复其肠道菌群组成。此外，粪便移植治疗方法已用于多种慢性胃肠疾病 ^{［47，52］}。

在临床治疗中，新鲜粪便样本可以通过缓冲液溶解和滤过进行再提炼。这些处理方法可去除粪便标本特殊气味（offensive odor），而且仍包含完整的和健康个体相同的菌群组成。其匀浆液可以注入患者肠道内并恢复患者肠道菌群组成，同时能够冷冻保藏并长期使用。考虑到肠道菌群中大多数细菌不能培养，粪便标本滤液的冷藏很好地解决了这一问题；粪便滤液冷藏能保存细菌的多样性及活力，当注入个体肠道内时能迅速定植。

粪便移植作为新的治疗方法，临床医生可以选择感兴趣的细菌制备成混悬液。该方法将需要找到一个标准化的粪便标本，其菌群组成配方可控制。采用粪便特定细菌培养的治疗方法处理患者并呈现出一定疗效，能很快地建立肠道菌群结构并能维持达6个月之久 ^［53］。然而，培养的细菌定植肠道的能力及其用于大样本CDI人群的治疗仍然有待验证。

肠道微生态结构和组成的个体差异给整体人肠道微生态的确立带来一定困难，并对这一领域的研究造成一定障碍。根据目前研究结果显示，益生菌作用的发挥是通过特定的种或菌株来完成 ^［54］；甚至单一的益生菌菌株也能通过多种或伴随方式发挥作用。目前，关于益生菌的作用机制研究主要集中在其诱导的天然免疫改变，主要涉及TLRs及其下游的信号通路，包括NF-κB、JAK/STAT、MAPK和SAPK/JNK通路 ^［54］。益生菌在IBD临床治疗中推广使用仍然存在限制，目前，最重要的限制主要是关于益生菌种和菌株的选择及动物模型选择的巨大差异 ^［55］。尽管不同的临床试验评价了益生菌在诱导和或维持IBD缓解中发挥一定作用，但是在这些临床实验中，其效果并不一致，而且缺乏大规模质量较高的对随机对照试验。另一个混杂因素是关于益生菌质量控制的问题。首先要确定商业通用的益生菌是否是像其声明的那样包含的是活体的微生物；其次，必须考虑用于治疗的益生菌配方（cocktails）中菌株成分的选择是否合理 ^［56］。未来有关新的提炼技术并确定“正常”和“治病”微生物并进一步阐明单一益生菌菌株的特定效应和作用机制将有助于改善治疗效果。随着研究不断深入，有效的益生菌治疗在未来IBD治疗中将成为可能 ^［57］。

其他改变肠道菌群的方法（other approaches to manipulate enteric flora）：目前已研究出菌种和菌株特定疫苗，如针对产肠毒素大肠埃希菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、致肾盂肾炎大肠埃希菌、复发的艰难梭菌感染（CDI）等。细菌素，由细菌产生并能抑制周围邻近细菌，已经被开发并作为添加成分来更好地保存食物。此外，研究认为噬菌体（bacteriophages）在操纵肠道菌群组成方面也具有一定的应用前景 ^［46］。

然而，若对肠道菌群结构和功能没有深入的理解，就不可能完全完成生物药物pharmabiotic的前景。因此，阐明宿主微生物相互影响的分子机制是细菌向药物转化（bugs to drugs）项目实现的先决条件。

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